2) только один антиген с использованием источников света разной длины волны
3) только один антиген на клетке по изменению цвета окраски
4) несколько маркеров одновременно на одной и той же клетке (+)
Многоцветная проточная цитометрия — это метод анализа клеток в суспензии, при котором для каждого отдельного клеточного события одновременно регистрируются параметры светорассеяния и сигналы от нескольких флуорохромов. Флуорохромы возбуждаются лазерным излучением и испускают свет в различных спектральных диапазонах, который фиксируется отдельными детекторами. Поэтому метод позволяет оценивать экспрессию нескольких антигенов на одной и той же клетке, то есть определять их сочетание и профиль коэкспрессии.
Клетки предварительно инкубируют с панелью моноклональных антител, каждое из которых конъюгировано с определённым флуорохромом. После прохождения клеток через измерительную камеру программное обеспечение выполняет компенсацию спектрального перекрытия сигналов и с помощью стратегии гейтирования выделяет интересующую популяцию. Именно анализ совокупности маркеров на уровне одной клетки обеспечивает точное иммунофенотипирование, в том числе установление линейной принадлежности, степени зрелости и аберрантного фенотипа опухолевых клеток.
В гематологии многоцветная проточная цитометрия применяется для диагностики острых лейкозов, лимфопролиферативных заболеваний, оценки минимальной остаточной болезни и исследования отдельных субпопуляций лимфоцитов. Определение одного антигена разными флуорохромами, использование различных длин волн само по себе или визуальная оценка изменения окраски не отражают сущность метода. Диагностически значимым является одновременное измерение нескольких параметров с последующей интерпретацией их сочетания в пределах одной клетки.
| Компонент метода | Принцип | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Исследуемый материал | Клетки крови, костного мозга, лимфатических узлов или других тканей переводят в суспензию | Обеспечивается анализ отдельных клеток, а не только усреднённого сигнала образца |
| Антитела | Используют панель антител к поверхностным и внутриклеточным антигенам | Позволяет одновременно оценивать несколько маркеров дифференцировки и активации |
| Флуорохромы | Каждое антитело связывают с флуорохромом с отличающимся спектром эмиссии | Формируется многопараметрический профиль клетки |
| Регистрация сигнала | Лазеры возбуждают флуорохромы, а оптические детекторы регистрируют интенсивность излучения | Количественно оценивается экспрессия антигенов и интенсивность их флуоресценции |
| Компенсация | Математически корректируется спектральное перекрытие сигналов соседних флуорохромов | Снижается риск ложной интерпретации позитивности маркеров |
| Гейтирование | Последовательно выделяются клетки по светорассеянию, жизнеспособности и сочетанию маркеров | Определяются патологические клеточные популяции и их фенотип |
| Основные клинические задачи | Иммунофенотипирование лейкозов и лимфом, оценка минимальной остаточной болезни | Уточняются диагноз, вариант заболевания, прогностические признаки и ответ на лечение |
Результат проточной цитометрии интерпретируют с учётом клинических данных, морфологии, цитогенетики и молекулярных исследований. Для достоверности анализа необходимы корректные контроли окраски, достаточное число зарегистрированных событий и стандартизированная панель антител. Выявление коэкспрессии антигенов особенно важно при распознавании аберрантного фенотипа опухолевого клона. При мониторинге минимальной остаточной болезни используются устойчивые лейкоз-ассоциированные иммунофенотипы и чувствительные многопараметрические панели.