2) выделение фрагмента ДНК, содержащего изучаемый ген
3) многократное повторение какого-либо участка ДНК (+)
4) идентификацию повторяющихся последовательностей в структуре ДНК
Амплификация генов — это увеличение числа копий определённой нуклеотидной последовательности ДНК. В лабораторной диагностике чаще всего используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), при которой целевой участок многократно копируется за последовательные циклы денатурации ДНК, отжига праймеров и элонгации новой цепи термостабильной ДНК-полимеразой. Благодаря этому даже небольшое исходное количество генетического материала становится достаточным для обнаружения и анализа.
Специфичность амплификации определяется праймерами — короткими олигонуклеотидами, комплементарными участкам, ограничивающим целевую последовательность. При оптимальных условиях количество ампликона увеличивается экспоненциально, поэтому метод применяют для выявления инфекционных агентов, патогенных вариантов генов, мутаций и количественной оценки экспрессии. В более широком биологическом смысле амплификацией также называют увеличение числа копий гена в геноме клетки вследствие нарушений репликации или структурных перестроек хромосом.
Амплификация не является установлением последовательности оснований, выделением гена или поиском повторяющихся элементов. Эти задачи соответствуют соответственно секвенированию, клонированию или выделению фрагмента ДНК и анализу повторов. При опухолевом процессе амплификация отдельных генов может иметь диагностическое и прогностическое значение, например увеличение копий ERBB2 (HER2) или MYCN обычно сопровождается повышенной экспрессией соответствующего белка.
| Вид амплификации или метод | Основной принцип | Что оценивают | Типичный диагностический результат |
|---|---|---|---|
| Конвенциональная ПЦР | Циклическое копирование целевого участка с праймерами | Наличие или отсутствие ампликона | Качественное выявление мутации, патогена или фрагмента гена |
| Количественная ПЦР (qPCR) | Регистрация флуоресценции в процессе накопления продукта | Количество исходной ДНК или кДНК | Пороговый цикл (Ct/Cq), обратно связанный с исходной концентрацией мишени |
| Цифровая ПЦР | Разделение образца на множество микрореакций с последующим подсчётом положительных и отрицательных реакций | Абсолютное число копий нуклеиновой кислоты | Высокочувствительное определение низкочастотных вариантов и остаточной опухолевой ДНК |
| Мультиплексная ПЦР | Одновременная амплификация нескольких мишеней с разными парами праймеров | Набор генов или участков в одной реакции | Параллельное выявление нескольких патогенных вариантов либо экзонов |
| Изотермическая амплификация | Многократное копирование ДНК или РНК при постоянной температуре без термоциклирования | Быстрое наличие целевой последовательности | Экспресс-диагностика инфекций и некоторых генетических мишеней |
| Геномная амплификация in vivo | Увеличение числа копий гена в клетке вследствие геномной нестабильности | Копийность локуса и связанное с ней повышение экспрессии | Амплификация HER2, MYCN и других генов при опухолях |
Таким образом, ключевой признак амплификации — образование большого числа копий исходной ДНК-мишени. Для подтверждения геномной амплификации используют количественную ПЦР, цифровую ПЦР, сравнительную геномную гибридизацию или секвенирование. Клиническая интерпретация зависит не только от числа копий, но и от типа исследуемого материала, порогов метода и связи выявленного изменения с заболеванием.