2) картировании определенных последовательностей ДНК непосредственно на хромосомных препаратах (+)
3) рестрикционном анализе структуры гена
4) определении нуклеотидной последовательности генов
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) основана на связывании меченого флуорохромом ДНК-зонда с комплементарной нуклеотидной последовательностью в клеточном ядре или на метафазной хромосоме. После денатурации ДНК зонд гибридизуется с определённым локусом, а флуоресцентный сигнал выявляется при микроскопии. Поэтому метод позволяет непосредственно определить положение, количество и взаимное расположение заданных последовательностей ДНК на хромосомном препарате.
Диагностически FISH применяют для выявления таргетных хромосомных нарушений: анеуплоидий, микроделеций и микродупликаций, амплификации генов, транслокаций, инверсий и потери локуса. В зависимости от задачи используют локус-специфические, центромерные, субтеломерные зонды, а также системы break-apart и dual-fusion для анализа перестроек. В отличие от секвенирования, FISH не определяет нуклеотидную последовательность, а в отличие от рестрикционного анализа не оценивает сайты действия рестриктаз; его основная задача — цитогенетическая локализация известной последовательности.
| Метод | Что выявляет | Основной диагностический результат | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| FISH | Заданную последовательность ДНК в ядре или на хромосоме | Локализация, число копий, наличие транслокации, делеции или амплификации | Необходим заранее известный участок-мишень; исследование не является полногеномным |
| Кариотипирование | Крупные изменения числа и структуры хромосом | Анеуплоидии, крупные делеции, дупликации и перестройки | Низкое разрешение; малые структурные варианты могут быть не видны |
| Хромосомный микроматричный анализ | Изменения числа копий по всему геному | Микроделеции и микродупликации, участки потери гетерозиготности | Обычно не выявляет сбалансированные транслокации и инверсии |
| ПЦР и MLPA | Конкретные фрагменты ДНК и количество экзонов или копий | Точечное подтверждение варианта, делеции или дупликации | Ограничены известными генами или участками; не дают цитогенетической картины |
| Рестрикционный анализ | Изменение структуры ДНК в области сайтов рестрикции | Косвенное выявление отдельных вариантов последовательности | Подходит только для вариантов, изменяющих соответствующий сайт или размер фрагмента |
| Секвенирование | Порядок нуклеотидов в исследуемом гене или панели генов | Точечные варианты, небольшие инсерции и делеции, некоторые варианты сплайсинга | Не предназначено для непосредственного картирования сигнала на хромосоме |
FISH особенно полезна, когда клиническое предположение указывает на конкретный хромосомный локус или перестройку. Исследование возможно как на метафазных хромосомах, так и в интерфазных ядрах, что позволяет быстро оценивать большое число клеток. Отрицательный результат FISH не исключает патологию вне зоны, распознаваемой использованным зондом, поэтому при неясном диагнозе метод дополняют кариотипированием, микроматричным анализом или секвенированием.