2) многоцветного сегментирования хромосом (mBAND)
3) массового параллельного секвенирования (MPS) (+)
4) сравнительной геномной гибридизации на высокоплотных ДНК-микрочипах (aCGH)
Криптическая инверсия представляет собой структурную перестройку, при которой участок хромосомы разворачивается на 180° без потери или приобретения генетического материала. При размере менее 1 млн пар нуклеотидов такая перестройка обычно не определяется стандартным цитогенетическим исследованием: изменяется порядок расположения последовательностей, но не их суммарное количество и не видимый под световым микроскопом морфологический рисунок хромосомы.
Массовое параллельное секвенирование (MPS), особенно полногеномное парно-концевое секвенирование, позволяет выявлять инверсию по структурным признакам: обнаружению пар прочтений с необычной ориентацией и разделённых прочтений, перекрывающих точки разрыва и повторного соединения ДНК. При наличии достаточной глубины покрытия и информативных уникальных последовательностей метод способен установить точные координаты инверсии и подтвердить её сбалансированный характер. Наиболее высокая чувствительность достигается при использовании длинных прочтений или комбинированных алгоритмов анализа структурных вариантов.
Сравнительная геномная гибридизация на микрочипах регистрирует преимущественно изменения числа копий и поэтому не выявляет сбалансированные инверсии. Многоцветное сегментирование хромосом (mBAND) повышает информативность флуоресцентного кариотипирования, но его разрешение ограничено размером и особенностями инвертированного участка. Хромосомная микродиссекция с последующим обратным окрашиванием также не обеспечивает надёжного обнаружения малых субмикроскопических перестроек.
| Метод | Основной регистрируемый признак | Возможность выявления инверсии менее 1 млн п. н. | Ключевое ограничение |
|---|---|---|---|
| Стандартное кариотипирование | Изменение размера, формы и полосчатого рисунка хромосом | Обычно не выявляет | Недостаточное разрешение и невозможность анализа молекулярных точек разрыва |
| Хромосомная микродиссекция с обратным окрашиванием | Морфологические и полосчатые особенности выделенного хромосомного материала | Как правило, недостаточно надёжно | Трудоёмкость, ограниченная разрешающая способность и необходимость видимого цитогенетического дефекта |
| mBAND | Изменение порядка расположения флуоресцентно меченых сегментов хромосомы | Возможно лишь в отдельных случаях, но не является оптимальным методом | Зависимость от набора зондов, размера перестройки и качества гибридизации |
| aCGH | Изменение относительного числа копий ДНК | Не выявляет сбалансированную инверсию | При инверсии содержание ДНК обычно сохраняется; метод информативен только при сопутствующей делеции или дупликации |
| Короткочиточное MPS | Разрывы последовательности, аномальная ориентация пар прочтений, split-read-сигналы | Может выявлять при достаточном покрытии и уникальности последовательностей | Ошибки в повторяющихся участках и при низкой аллельной доле варианта |
| Длинночиточное MPS | Непосредственное перекрытие протяжённых участков и точек разрыва одной молекулой | Высокая информативность, в том числе для сложных инверсий | Более высокая стоимость и требования к качеству ДНК |
Выбор MPS особенно обоснован при подозрении на структурный вариант, не сопровождающийся изменением числа копий. Выявленная инверсия должна оцениваться с учётом её геномного контекста, вовлечения кодирующих последовательностей и регуляторных элементов, а также клинического фенотипа пациента. Для подтверждения точек разрыва могут применяться таргетное секвенирование, ПЦР с праймерами по обе стороны предполагаемых соединений или длинночиточное секвенирование. При обнаружении перестройки важно установить её происхождение и проверить родителей, поскольку инверсия может быть наследуемой или возникать de novo.