2) центромеро-специфичного ДНК-зонда на одну пару гомологичных хромосом
3) комбинации двух центромеро-специфичных ДНК-зондов на разные хромосомы, меченных разными флуорохромами (+)
4) субтеломерного ДНК-зонда на одну пару гомологичных хромосом
Триплоидия представляет собой наличие трёх гаплоидных наборов хромосом — 69 хромосом вместо нормальных 46. В интерфазных ядрах её можно выявить методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) с использованием двух центромероспецифичных ДНК-зондов, направленных на разные хромосомы и меченных различными флуорохромами. В нормальном диплоидном ядре каждый зонд формирует обычно два сигнала, тогда как при триплоидии регистрируются по три сигнала каждого из двух независимых зондов.
Применение двух зондов повышает специфичность диагностики: одновременное выявление трёх центромерных сигналов для разных хромосом подтверждает общий характер увеличения плоидности, а не изолированную трисомию одной хромосомы. Один центромерный зонд может показать только трисомию соответствующей хромосомы и не позволяет доказать триплоидный набор. Субтеломерный зонд также оценивает преимущественно конкретный хромосомный участок и предназначен для выявления дисбалансов или перестроек, но не для прямой оценки числа полных хромосомных наборов.
Сравнительная геномная гибридизация отражает относительные изменения дозы генетического материала по всему геному, однако при исследовании плоидности её результаты зависят от метода нормализации и типа контрольного образца и не дают столь прямого критерия, как подсчёт центромерных сигналов. Для подтверждения результата анализируют достаточное число неперекрывающихся ядер и учитывают возможный мозаицизм, при котором доля клеток с тремя сигналами может быть снижена.
| Подход | Ожидаемый результат | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Два центромероспецифичных FISH-зонда разных цветов | По 3 сигнала каждого цвета в одном интерфазном ядре | Наиболее подходящий способ подтверждения триплоидии без культивирования клеток |
| Один центромероспецифичный зонд | 3 сигнала только для одной хромосомы | Подтверждает возможную трисомию, но не общий триплоидный набор |
| Один субтеломерный зонд | Изменение числа или расположения сигналов в конкретной области | Выявляет локальный дисбаланс или перестройку, но не плоидность всего генома |
| Сравнительная геномная гибридизация | Изменение относительной интенсивности гибридизации по участкам генома | Полезна для анализа копийности, но менее специфична для прямого доказательства триплоидии |
| Кариотипирование метафазных клеток | 69,XXX; 69,XXY или 69,XYY | Цитогенетическое подтверждение полной или мозаичной триплоидии при наличии делящихся клеток |
| Молекулярный анализ STR-маркеров | Три аллельных пика либо дисбаланс родительского происхождения | Позволяет подтвердить дополнительный гаплоидный набор и установить его происхождение |
Результат FISH следует интерпретировать с учётом числа исследованных ядер, качества гибридизации и порогов лаборатории. При подозрении на мозаичную форму необходим подсчёт большого количества клеток и, при возможности, исследование материала из разных тканей. Окончательная верификация может включать кариотипирование, молекулярное исследование или количественную ПЦР.