2) уникальных локус-специфичных ДНК-зондов на последовательности генов BCR и ABL, меченных одним флуоресцентным красителем
3) уникальных локус-специфичных ДНК-зондов на последовательности генов BCR и ABL, меченных разными флуорохромами (+)
4) центромеро-специфичных ДНК-зондов на хромосомы 9 и 14/22, меченных разными флуорохромами
Для выявления транслокации t(9;22)(q34.1;q11.2), формирующей химерный ген BCR::ABL1, в интерфазных ядрах применяют двухцветные локус-специфичные ДНК-зонды, комплементарные участкам генов BCR и ABL1. Каждый ген маркируется своим флуорофором, поэтому при сближении и слиянии соответствующих участков на дериватной хромосоме возникает совмещённый (fusion) сигнал. Такой вариант FISH позволяет исследовать клетки без получения метафазных пластинок и быстро установить наличие клона с BCR::ABL1.
Химерный ген кодирует конститутивно активную тирозинкиназу BCR::ABL1, которая запускает сигнальные пути пролиферации и подавляет апоптоз миелоидных клеток; это молекулярная основа хронического миелоидного лейкоза. При классическом паттерне двухцветной двухфузионной FISH в ядре выявляют два сигнала слияния, соответствующие реципрокным продуктам транслокации, и по одному раздельному сигналу каждого цвета. Вариант с одинаковой меткой для обоих локусов не позволяет надёжно отличить их совместную локализацию, а центромерные или субтеломерные зонды не подтверждают непосредственно перестройку генов BCR и ABL1.
| Подход | Мишень | Информативный результат | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Двухцветная двухфузионная FISH | Локус-специфичные участки BCR и ABL1 | Совмещённые сигналы двух цветов | Прямое выявление перестройки BCR::ABL1 в интерфазных ядрах |
| Типичный FISH-паттерн при t(9;22) | Два флуорофора, специфичных для BCR и ABL1 | Обычно 2 fusion-, 1 красный и 1 зелёный сигнал | Поддерживает наличие классической реципрокной транслокации |
| Нормальный клеточный клон | Два раздельных локуса BCR и два раздельных локуса ABL1 | Раздельные сигналы без патологического слияния | Транслокация t(9;22) не выявлена данным методом |
| Одноцветные зонды к BCR и ABL1 | Те же локусы, но одинаковая флуоресцентная метка | Невозможно достоверно различить происхождение и колокализацию сигналов | Недостаточная специфичность для двухцветного fusion-анализа |
| Центромерные зонды | Центромеры хромосом 9, 14 или 22 | Изменение числа или расположения центромерных сигналов | Оценивают числовые аномалии, но не подтверждают BCR::ABL1 |
| Субтеломерные зонды | Теломерные участки длинных плеч хромосом | Неспецифическое сближение или изменение сигналов | Могут указывать на перестройку, но не идентифицируют генную мишень |
| Количественная ОТ-ПЦР | Транскрипт BCR::ABL1 в РНК | Определение уровня транскрипта | Основной метод молекулярного мониторинга ответа на терапию ингибиторами тирозинкиназы |
FISH особенно полезна при исследовании интерфазных клеток, когда цитогенетический анализ метафаз ограничен низкой митотической активностью или недостаточным качеством препарата. Отрицательный результат FISH не исключает редкие криптические или атипичные варианты перестройки, поэтому при сохраняющемся клиническом подозрении применяют ОТ-ПЦР или секвенирование. Для подтверждения диагноза и последующего наблюдения важно также определить тип транскрипта BCR::ABL1 и его количественный уровень. Ответ на терапию оценивают преимущественно по динамике молекулярной нагрузки, а не только по факту наличия транслокации.