2) MLPA
3) сравнительную геномную гибридизацию
4) стандартное цитогенетическое исследование
Для выявления микроделеций локусов AZF длинного плеча Y-хромосомы применяют таргетную мультиплексную ПЦР. Метод основан на одновременной амплификации нескольких STS-маркеров — коротких участков ДНК с известным положением в регионах AZFa, AZFb и AZFc. Отсутствие продукта амплификации конкретного маркера при нормальном результате внутренних и внешних контролей указывает на утрату соответствующего участка Y-хромосомы. Согласно рекомендациям EAA/EMQN, базовая мультиплексная ПЦР с последующим уточнением границ делеции остается стандартным методом диагностики клинически значимых AZF-делеций.
Микроделеции AZF обычно возникают вследствие неаллельной гомологичной рекомбинации между повторяющимися последовательностями Y-хромосомы и приводят к утрате генов, необходимых для сперматогенеза. Клинически они ассоциированы прежде всего с необструктивной азооспермией или выраженной олигозооспермией. В базовую панель включают валидированные маркеры sY84 и sY86 для AZFa, sY127 и sY134 для AZFb, sY254 и sY255 для AZFc; выявленный результат подтверждают повторным исследованием и расширенным картированием границ делеции.
Стандартное кариотипирование не обладает достаточным разрешением для обнаружения субмикроскопических интерстициальных делеций. MLPA и хромосомный микроматричный анализ способны выявлять изменения числа копий при наличии подходящих зондов, однако не являются предпочтительным первичным методом для типичных AZF-микроделеций: палиндромная и многокопийная структура мужской специфической области Y-хромосомы затрудняет интерпретацию. Поэтому при обследовании мужчины с тяжелым нарушением сперматогенеза оптимальным является направленный анализ заранее определенных STS-локусов методом ПЦР.
| Метод | Диагностический принцип | Значение при микроделециях Y-хромосомы |
|---|---|---|
| Мультиплексная ПЦР STS-маркеров | Определение наличия или отсутствия амплификации выбранных локусов AZFa, AZFb и AZFc | Предпочтительный метод первичной диагностики типичных AZF-делеций |
| Расширенная ПЦР-картография | Исследование дополнительных маркеров вокруг выявленного дефекта | Уточняет полноту и границы делеции, важные для прогноза сперматогенеза |
| MLPA | Сравнительная количественная оценка числа копий участков, к которым гибридизуются зонды | Может выявлять делеции и дупликации, но результат зависит от состава диагностической панели |
| Хромосомный микроматричный анализ | Геномное выявление потерь и увеличений числа копий ДНК | Полезен при крупных или атипичных перестройках; разрешение в повторных областях Y-хромосомы ограничено |
| Стандартное кариотипирование | Микроскопическая оценка количества и структуры хромосом | Выявляет анеуплоидии и крупные перестройки, но обычно не обнаруживает микроделеции AZF |
| FISH | Гибридизация флуоресцентного зонда с выбранным участком хромосомы | Применяется для подтверждения отдельных перестроек, но не заменяет стандартную STS-ПЦР-панель |
Тип выявленной делеции имеет прогностическое значение. Полные делеции AZFa и AZFb обычно связаны с крайне низкой вероятностью обнаружения сперматозоидов при тестикулярной экстракции, тогда как при делеции AZFc сперматозоиды могут сохраняться в эякуляте или ткани яичка. Перед применением интрацитоплазматической инъекции сперматозоида требуется медико-генетическое консультирование, поскольку сын наследует измененную Y-хромосому и связанную с ней предрасположенность к нарушению сперматогенеза. Результат исследования следует интерпретировать совместно со спермограммой, гормональным профилем и кариотипом пациента.