2) FISH с центромерными ДНК-зондами на хромосомы, вовлеченные в перестройку
3) сравнительную геномную гибридизацию на метафазных хромосомах
4) хромосомный микроматричный анализ
При сложной хромосомной перестройке с участием трёх негомологичных хромосом наиболее информативно многоцветное окрашивание хромосом — многоцветная FISH (mFISH) или спектральное кариотипирование (SKY). Метод основан на использовании набора ДНК-зондов, специфичных для отдельных хромосом и меченных различными флуорохромами. Благодаря уникальной комбинации цветов каждый участок производной хромосомы можно соотнести с хромосомой-источником, что позволяет выявить трёхстороннюю транслокацию и определить состав сложных производных хромосом.
Особенно важно применение mFISH при недостаточной информативности стандартного G-окрашивания, когда множественные обмены участками могут имитировать простую транслокацию или быть частично скрытыми. Центромерные FISH-зонды подтверждают наличие и число центромер, но не позволяют проследить происхождение дистальных сегментов. Сравнительная геномная гибридизация и хромосомный микроматричный анализ выявляют преимущественно дисбаланс генетического материала — делеции и дупликации; сбалансированные перестройки без изменения числа копий при этих методах обычно не определяются.
Таким образом, многоцветное окрашивание является методом выбора для установления хромосомного происхождения всех фрагментов при сложной перестройке. При необходимости уточнения локализации точек разрыва применяют дополнительные локус-специфические FISH-зонды, оптическое картирование или методы секвенирования. Интерпретация результата должна учитывать, является ли перестройка сбалансированной либо сопровождается потерей или приобретением генетического материала.
| Метод | Основной принцип | Что выявляет | Ограничения при сложной перестройке |
|---|---|---|---|
| Многоцветная FISH (mFISH, SKY) | Одновременная гибридизация набора хромосомоспецифичных зондов с различными комбинациями флуорохромов | Происхождение участков производных хромосом, многоточечные и многосторонние транслокации | Ограниченная точность определения точки разрыва; для микроперестроек нужны дополнительные зонды |
| FISH с центромерными зондами | Гибридизация с альфа-сателлитной ДНК центромер конкретных хромосом | Число и наличие центромер, отдельные случаи анеуплоидии или маркерных хромосом | Не определяет состав плеч и терминальных сегментов, поэтому не реконструирует сложный обмен участками |
| Сравнительная геномная гибридизация на метафазных хромосомах | Сравнение интенсивности флуоресценции ДНК пациента и контроля после гибридизации на метафазах | Крупные делеции и дупликации, то есть изменения дозы генетического материала | Не выявляет сбалансированные транслокации и инверсии; разрешение ниже, чем у микроматричного анализа |
| Хромосомный микроматричный анализ | Высокоразрешающее исследование вариаций числа копий по всему геному | Субмикроскопические делеции, дупликации и некоторые участки с нарушением копийности | Обычно не обнаруживает сбалансированные перестройки, при которых суммарная дозировка ДНК сохранена |
| Стандартное кариотипирование с G-окрашиванием | Морфологический анализ числа и структуры хромосом в метафазе | Крупные транслокации, инверсии, делеции и дупликации | Сложные перестройки могут быть неправильно классифицированы или не распознаны из-за сходства полос и малого размера фрагментов |
| Локус-специфическая FISH | Гибридизация зондов к конкретным генам или участкам хромосом | Подтверждение разрыва в известном локусе, вовлечение конкретного гена, уточнение результата mFISH | Не подходит для первичного поиска неизвестных многочисленных участников перестройки |
При выявлении сложной перестройки следует сопоставлять результаты mFISH с данными стандартного кариотипа и анализом геномного дисбаланса. Если перестройка сбалансирована, фенотип может отсутствовать, однако повышается риск образования несбалансированных гамет и репродуктивных потерь. Обнаружение потери или приобретения хромосомного материала требует оценки клинической значимости вовлечённых регионов и генетического консультирования.