2) хромосомного микроматричного анализа
3) количественной мультиплексной лигазной реакции (+)
4) флуоресцентной гибридизации in situ
Количественная мультиплексная лигазная реакция, чаще обозначаемая как MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification), позволяет одновременно исследовать множество заранее выбранных участков ДНК и оценивать относительное число их копий. Для каждого локуса используются две половины специфического зонда, которые гибридизуются рядом на исследуемой последовательности и лигируются только при точном соответствии мишени. После общей ПЦР-амплификации количество полученного продукта пропорционально числу копий соответствующего участка, что позволяет выявлять протяжённые делеции и дупликации, а при соответствующем наборе зондов — изменения числа целых хромосом.
Дополнительным преимуществом метода является возможность таргетного выявления заранее известных точковых вариантов. Если нуклеотидная замена располагается непосредственно в области гибридизации или в месте лигирования зонда, несовпадение последовательности препятствует нормальной лигазной реакции и изменяет амплитуду соответствующего сигнала. Поэтому MLPA может в рамках одного исследования сочетать анализ копийности и тестирование определённых известных вариантов, хотя для поиска неизвестных точковых мутаций секвенирование остаётся более подходящим методом.
Другие цитогенетические и молекулярно-цитогенетические методы имеют более узкие возможности. Кариотипирование эффективно для крупных хромосомных перестроек и анеуплоидий, но имеет недостаточное разрешение для небольших изменений и не выявляет точковые варианты. Хромосомный микроматричный анализ хорошо обнаруживает субмикроскопические изменения числа копий по всему геному, однако стандартно не предназначен для диагностики конкретных однонуклеотидных замен, а FISH исследует только заранее выбранные хромосомные локусы.
| Метод | Основные выявляемые нарушения | Особенности и ограничения |
|---|---|---|
| MLPA | Делеции и дупликации выбранных экзонов или локусов | Высокая мультиплексность и количественная оценка числа копий |
| MLPA | Анеуплоидии при наличии соответствующих хромосомных зондов | Подходит для быстрого таргетного анализа нескольких хромосом |
| MLPA | Известные точковые варианты | Выявляются специально сконструированными аллель-специфическими зондами |
| Кариотипирование | Анеуплоидии, крупные структурные перестройки | Низкое разрешение; точковые мутации не определяются |
| Хромосомный микроматричный анализ | Геномные делеции и дупликации, в зависимости от платформы — участки гомозиготности | Высокое разрешение для CNV, но стандартный CMA не является методом поиска точковых мутаций |
| FISH | Анеуплоидии и перестройки конкретных локусов | Таргетный анализ ограниченного числа заранее выбранных участков |
| Секвенирование | Однонуклеотидные варианты и малые инделы | Наиболее информативно для поиска неизвестных точковых изменений; анализ CNV требует специальных алгоритмов или дополнительных методов |
MLPA особенно востребована при заболеваниях, для которых характерны экзонные или мультиэкзонные делеции и дупликации, например при ряде наследственных нервно-мышечных и опухолевых синдромов. Метод является таргетным: диагностические возможности определяются составом используемого набора зондов. Поэтому отсутствие изменения сигнала не исключает мутации вне исследуемых участков. При выявлении необычного профиля копийности результат в зависимости от клинической задачи может потребовать подтверждения альтернативным молекулярно-генетическим методом.