2) секвенирования (+)
3) электрофореза в акриламидном геле
4) ПЦР-ПДРФ
Секвенирование применяют для поиска неизвестных мутаций, поскольку метод позволяет непосредственно определить последовательность нуклеотидов исследуемого участка ДНК и сопоставить её с референсной последовательностью. В результате выявляются замены нуклеотидов, небольшие делеции и вставки, а при использовании соответствующих технологий — и более сложные варианты. Для анализа одного или нескольких фрагментов часто используют секвенирование по Сэнгеру, а при исследовании большого числа генов — массовое параллельное секвенирование (NGS).
Принцип метода заключается в регистрации последовательности вновь синтезируемой ДНК. При секвенировании по Сэнгеру включение терминирующих флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов приводит к образованию фрагментов разной длины, по которым восстанавливается последовательность. В NGS одновременно считываются миллионы коротких фрагментов, что позволяет анализировать панели генов, экзом или геном. Существенное преимущество секвенирования состоит в отсутствии необходимости заранее знать конкретную мутацию или её положение.
Другие перечисленные методы преимущественно предназначены для выявления заранее предполагаемого варианта или косвенных различий между аллелями. ПЦР в реальном времени обычно используют для обнаружения конкретной замены, определения числа копий или количественной оценки нуклеиновой кислоты; ПЦР-ПДРФ основана на изменении сайта рестрикции, связанном с известной мутацией. Электрофорез может показать различие размеров или конформации фрагментов, но сам по себе не определяет точную нуклеотидную последовательность и часто требует последующего секвенирования.
| Метод | Основной принцип | Выявление неизвестных мутаций | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Секвенирование по Сэнгеру | Определение последовательности отдельного амплифицированного фрагмента по терминирующим флуоресцентным нуклеотидам | Да, особенно в одном гене или конкретном экзоне | Подтверждение варианта, анализ небольших генов и отдельных участков |
| Массовое параллельное секвенирование (NGS) | Параллельное считывание большого числа фрагментов ДНК с последующим биоинформатическим анализом | Да, включая ранее не описанные варианты в исследуемых областях | Генные панели, секвенирование экзома или генома |
| ПЦР в реальном времени | Регистрация накопления ампликона по флуоресцентному сигналу, часто с использованием аллель-специфичных зондов | Обычно нет; метод ориентирован на заранее известную последовательность | Быстрое подтверждение конкретной мутации, количественный анализ, оценка числа копий |
| ПЦР-ПДРФ | Амплификация участка и расщепление продукта рестриктазой при наличии или отсутствии определённого сайта | Нет, если мутация не изменяет заранее известный сайт рестрикции | Генотипирование известных точечных вариантов |
| Электрофорез в полиакриламидном геле | Разделение фрагментов ДНК по размеру или конформационным особенностям | Ограниченно; возможен скрининг различий, но не точная идентификация замены | Анализ небольших инделов, продуктов ПЦР, некоторых методов скрининга |
| MLPA | Гибридизация зондов и количественная оценка отдельных экзонов или участков гена | Не выявляет большинство точечных замен, но обнаруживает неизвестные делеции и дупликации | Поиск крупных копийных изменений при подозрении на структурный дефект гена |
Обнаруженный при секвенировании вариант не всегда является патогенной мутацией: его клиническое значение оценивают с учётом частоты в популяции, влияния на белок, данных функциональных исследований, фенотипа пациента и семейного анализа. Для клинически значимых находок рекомендуется подтверждение независимым методом, чаще секвенированием по Сэнгеру. При отрицательном результате необходимо учитывать качество покрытия, наличие плохо анализируемых участков и возможность крупных структурных перестроек. Поэтому выбор дополнительного метода зависит от предполагаемого типа генетического дефекта.