2) механическую сортировку клеточных популяций для определения уровня хромосомного мозаицизма
3) разрезание материала определенной хромосомы на препарате на отдельные фрагменты с целью создания хромосомо-специфичного ДНК-зонда
4) изоляцию хромосомного материала, являющегося объектом исследования, из метафазной пластики с помощью механического, либо лазерного микродиссектора, и получение на его основе ДНК-зонда для обратной in situ гибридизации (+)
Хромосомная микродиссекция — метод молекулярной цитогенетики, при котором под микроскопическим контролем из метафазной пластинки целенаправленно выделяют конкретную хромосому, ее участок или аномальный хромосомный фрагмент. Изоляция выполняется механическим микроманипулятором либо лазерным микродиссектором. Полученное небольшое количество ДНК затем амплифицируют, например методом DOP-PCR, и используют для приготовления меченого ДНК-зонда. Поэтому наиболее полное определение метода включает и физическое выделение исследуемого материала, и последующее получение на его основе зонда.
Принцип обратной флуоресцентной гибридизации in situ (reverse FISH, или reverse chromosome painting) состоит в том, что зонд получают не из заранее известной нормальной хромосомы, а непосредственно из исследуемого аномального хромосомного материала. После амплификации и мечения такой зонд гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами; локализация флуоресцентного сигнала позволяет установить хромосомное происхождение маркерной хромосомы, дополнительного материала или сегментов сложной структурной перестройки. Именно сочетание микродиссекции с обратной FISH делает метод особенно полезным при характеристике цитогенетически неясных маркерных и дериватных хромосом.
Простое разрезание определенной хромосомы на фрагменты с целью создания хромосомоспецифичного зонда отражает лишь один из возможных технических вариантов и не раскрывает диагностический принцип метода полностью. Микродиссекция не является сортировкой клеточных популяций и сама по себе не предназначена для количественного определения хромосомного мозаицизма. Ее ключевая особенность — селективное извлечение морфологически выбранного хромосомного материала с последующим молекулярным воспроизведением выделенной ДНК и ее использованием в гибридизационном анализе.
| Этап или подход | Содержание | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Выбор объекта | Идентификация целой хромосомы, маркерной хромосомы или интересующего хромосомного участка в метафазной пластинке | Позволяет исследовать конкретный структурно измененный материал |
| Механическая микродиссекция | Физическое отделение выбранного участка с помощью микроманипулятора и микроиглы | Обеспечивает прицельное получение ДНК из морфологически выбранной области |
| Лазерная микродиссекция | Изоляция хромосомы или ее сегмента сфокусированным лазерным микропучком | Повышает точность отбора материала и уменьшает риск примеси соседних участков |
| Амплификация ДНК | Размножение малого количества выделенной ДНК, в том числе с применением DOP-PCR | Создает достаточное количество материала для приготовления гибридизационного зонда |
| Получение FISH-зонда | Амплифицированную ДНК метят флуорофором или другим детектируемым маркером | Формируется хромосомо- или регион-специфичный зонд для последующей гибридизации |
| Обратная FISH | Зонд из аномального материала гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами | Устанавливает происхождение неизвестного хромосомного материала и состав структурной перестройки |
| Сортировка клеток | Разделение клеточных популяций по физическим или молекулярным признакам | Это самостоятельный подход; он не является хромосомной микродиссекцией и решает иные диагностические задачи |
Хромосомная микродиссекция относится к методам целевой молекулярно-цитогенетической характеристики хромосомных перестроек. На ее основе могут создаваться зонды для окрашивания целых хромосом, отдельных плеч или ограниченных хромосомных регионов. Особенно ценен метод при исследовании маркерных хромосом и сложных перестроек, когда стандартное кариотипирование не позволяет уверенно определить происхождение дополнительного материала. Таким образом, определяющим признаком микродиссекции является последовательность прицельная изоляция хромосомного материала → амплификация ДНК → получение зонда → гибридизационная идентификация .