2) набором клонированных последовательностей генов, локализованных на определенной паре гомологичных хромосом
3) клонированными последовательностями сателлитной ДНК, специфичными определенной паре гомологичных хромосом в кариотипе
4) короткими клонированными уникальными последовательностями ДНК, специфичными для определенной пары гомологичных хромосом в кариотипе (+)
Хромосомо-специфический зонд для FISH представляет собой клонированный фрагмент уникальной ДНК, комплементарный последовательности, расположенной на конкретной хромосоме. Уникальность обеспечивает преимущественное связывание зонда только с одним хромосомным локусом и минимизирует перекрёстную гибридизацию с другими участками генома. Поэтому наиболее точным является описание в виде коротких клонированных уникальных последовательностей, специфичных для определённого типа хромосомы; гомологичные хромосомы содержат одинаковую мишень, но происходят от разных родителей.
В методе FISH ДНК-зонд и исследуемый препарат денатурируют до одноцепочечного состояния, после чего происходит комплементарная гибридизация зонда с целевой последовательностью в метафазных хромосомах или интерфазных ядрах. Флуоресцентная метка позволяет визуализировать сигнал в люминесцентном микроскопе. В нормальном диплоидном ядре обычно выявляют два сигнала для аутосомного локуса; отсутствие одного сигнала может указывать на делецию, три сигнала — на трисомию, а изменение расположения или разделение сигналов — на структурную перестройку.
Набор генов не является обязательным компонентом такого зонда: целевая последовательность может находиться в межгенном участке. Сателлитная ДНК действительно используется для центромерных и некоторых хромосомно-специфичных зондов, однако она состоит из повторяющихся последовательностей и не отражает общий принцип построения локус-специфического зонда. Универсальный набор фрагментов ДНК различной длины без указания уникальности и хромосомной специфичности также не обеспечивает требуемой диагностической точности.
| Тип ДНК-зонда | Структурная особенность | Основное применение | Интерпретация сигнала |
|---|---|---|---|
| Локус-специфический | Уникальная клонированная последовательность, комплементарная определённому участку хромосомы | Выявление микроделеций, дупликаций, амплификации, локализация гена или перестройки | Изменение числа или положения сигналов указывает на аномалию целевого локуса |
| Центромерный | Повторяющиеся альфа-сателлитные последовательности | Быстрый подсчёт отдельных хромосом и диагностика анеуплоидий | Три сигнала вместо двух характерны для трисомии; отсутствие сигнала может соответствовать моносомии |
| Теломерный или субтеломерный | Последовательности в терминальных участках хромосом | Поиск терминальных делеций и дупликаций, не видимых при стандартном кариотипировании | Потеря или дополнительный сигнал в дистальном участке свидетельствует о дисбалансе |
| Зонд полного хромосомного окрашивания | Смесь множества меченых фрагментов, распределённых по всей хромосоме | Выявление крупных транслокаций и сложных хромосомных перестроек | Изменение окраски материала позволяет установить происхождение фрагмента хромосомы |
| Break-apart-зонд | Два флуоресцентно меченых фрагмента по разные стороны от исследуемого гена | Обнаружение разрыва или перестройки конкретного гена | Разделение сигналов вместо их сближения указывает на нарушение целостности локуса |
| Fusion-зонд | Два зонда к генам или участкам, которые при перестройке сближаются | Диагностика специфических слияний генов, например при опухолевых транслокациях | Появление совмещённого сигнала свидетельствует о формировании химерного локуса |
FISH является целевым методом: он отвечает на заранее сформулированный вопрос о конкретной хромосоме или локусе, но не заменяет полногеномный поиск перестроек. Преимущество метода заключается в возможности исследовать не только метафазные хромосомы, но и интерфазные ядра, что ускоряет диагностику. Отрицательный результат означает отсутствие изменения именно в зоне, распознаваемой данным зондом, и не исключает патологии в других участках генома. Выбор типа зонда определяется предполагаемой аномалией и клинической задачей.