2) центромеро-специфичного ДНК-зонда на хромосому 21
3) спектрального кариотипирования
4) набора ДНК-зондов для многоцветной гибридизации in situ
Оптимальным методом является интерфазная FISH с локус-специфическим ДНК-зондом, комплементарным уникальной последовательности хромосомы 21. После денатурации ДНК зонд гибридизуется с соответствующим участком в ядрах интерфазных клеток, а число флуоресцентных сигналов отражает количество копий исследуемой последовательности: обычно два сигнала соответствуют диплоидному набору, три — наиболее вероятной трисомии 21. Метод позволяет исследовать некультивируемые клетки и получить результат значительно быстрее, чем при стандартном кариотипировании.
Интерфазный анализ особенно полезен для экспресс-диагностики синдрома Дауна в амниотических клетках, клетках хориона, периферической крови и других образцах. При мозаицизме оценивают долю ядер с различным числом сигналов; диагностическое заключение выносят с учетом валидированного лабораторного порога, качества препаратов и исключения артефактов, включая перекрытие сигналов и неполные ядра. Локус-специфическая последовательность обеспечивает адресную идентификацию хромосомы 21, хотя результат отражает число копий конкретного участка, а не дает полного представления о структуре всех хромосом.
Центромеро-специфические зонды также могут применяться для подсчета центромер, однако они дают информацию преимущественно о числе центромерных областей и не характеризуют выбранный уникальный локус. Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH предназначены главным образом для анализа метафазных хромосом, выявления сложных перестроек и определения происхождения маркерных хромосом, поэтому менее целесообразны для быстрого подсчета копий хромосомы 21 в интерфазных ядрах.
| Метод | Основная мишень | Стадия клеточного цикла | Диагностические возможности | Ограничения |
|---|---|---|---|---|
| Локус-специфическая FISH | Уникальная последовательность хромосомы 21 | Интерфаза и метафаза | Быстрый подсчет сигналов; выявление вероятной трисомии 21 и мозаицизма | Не оценивает весь геном и не исключает перестройки вне исследуемого локуса |
| Центромеро-специфическая FISH | Альфа-сателлитная центромерная ДНК хромосомы 21 | Преимущественно интерфаза | Оценка числа центромер и экспресс-скрининг анеуплоидии | Не дает информации о других участках хромосомы и может быть недостаточна для уточнения локусных изменений |
| Стандартное кариотипирование | Все хромосомы в виде метафазных пластинок | Метафаза | Подтверждение числовых аномалий, крупных структурных перестроек и транслокаций | Требует культивирования клеток и занимает больше времени |
| Спектральное кариотипирование | Все хромосомы, окрашенные различными спектральными метками | Метафаза | Установление происхождения сложных и маркерных хромосом | Не является оптимальным методом для рутинного подсчета сигналов в интерфазных ядрах |
| Многоцветная FISH (M-FISH) | Набор зондов, окрашивающих разные хромосомы в различные цвета | Преимущественно метафаза | Анализ множественных хромосомных перестроек и сложных кариотипов | Ограниченная применимость для быстрой изолированной оценки хромосомы 21 |
| Хромосомный микроматричный анализ | Копийность ДНК по всему геному | Не зависит от клеточного цикла | Выявление микроделеций, микродупликаций и дисбалансов копий | Не обнаруживает сбалансированные перестройки и обычно не используется как экспресс-метод подсчета отдельных ядер |
Положительный результат FISH следует интерпретировать совместно с клиническими данными и результатами стандартного цитогенетического или молекулярного исследования. При выявлении трех сигналов необходимо учитывать мозаицизм, случайную потерю сигнала и возможную контаминацию материнскими клетками в пренатальном материале. Для окончательной характеристики кариотипа и исключения структурных вариантов могут потребоваться кариотипирование, хромосомный микроматричный анализ или другие методы. Таким образом, локус-специфическая FISH является быстрым и адресным способом оценки числа копий участка хромосомы 21 в интерфазных клетках.