2) определение фолдинга
3) исследование взаимодействия ДНК с белками
4) пришивание одного участка ДНК к другому (+)
Лигирование ДНК — это ферментативное соединение двух фрагментов нуклеиновой кислоты в единую непрерывную молекулу. Реакцию катализирует ДНК-лигаза, которая формирует ковалентную фосфодиэфирную связь между 3′-гидроксильной группой одного фрагмента и 5′-фосфатной группой другого. Для активации субстрата используются АТФ либо НАД+ — в зависимости от происхождения и типа лигазы.
Наиболее эффективно соединяются фрагменты с комплементарными одноцепочечными выступами, или липкими концами : после их спаривания лигаза стабилизирует сахарофосфатный остов. Возможно также сшивание фрагментов с тупыми концами, но такая реакция обычно менее эффективна и требует более высокой концентрации фермента или специальных условий. Лигирование лежит в основе конструирования рекомбинантных молекул ДНК, присоединения адаптеров в технологиях секвенирования нового поколения и репарации одноцепочечных разрывов.
| Вариант лигирования | Особенность концов ДНК | Механизм и результат | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Лигирование липких концов | Комплементарные одноцепочечные выступы | Гибридизация выступов повышает специфичность и эффективность соединения | Клонирование фрагмента после рестрикционного расщепления |
| Лигирование тупых концов | Двухцепочечные концы без выступов | Соединение происходит без предварительного спаривания оснований; реакция менее эффективна | Сборка фрагментов, несовместимых по последовательности концов |
| Межмолекулярное лигирование | Концы двух разных молекул ДНК | Формируется рекомбинантная молекула с объединёнными фрагментами | Встраивание целевого гена в плазмидный вектор |
| Внутримолекулярное лигирование | Концы одной молекулы ДНК | Линейный фрагмент замыкается в кольцевую структуру | Получение рекомбинантной плазмиды |
| Запечатывание ника | Одноцепочечный разрыв при сохранённом спаривании цепей | Лигаза восстанавливает непрерывность фосфодиэфирного остова | Репарация ДНК и завершение реакций амплификации или клонирования |
| Лигирование адаптеров | Специально синтезированные олигонуклеотидные адаптеры | К концам ДНК присоединяются последовательности для праймирования и идентификации образца | Подготовка библиотек для массового параллельного секвенирования |
Лигирование не определяет нуклеотидную последовательность и не характеризует пространственную укладку ДНК или её взаимодействие с белками. Ключевым критерием реакции является образование новой фосфодиэфирной связи между ранее разобщёнными фрагментами. При лабораторной оценке учитывают совместимость концов, наличие 5′-фосфатных групп, активность лигазы и присутствие кофактора. Поэтому присоединение одного участка ДНК к другому является точным молекулярно-биологическим определением данного процесса.