2) кальций-фосфатной трансфекции
3) обратной транскрипции
4) трансформации
Метафектен и Липофектамин относятся к реагентам для липофекции — разновидности невирусной трансфекции, при которой нуклеиновые кислоты доставляются в клетки с помощью липидных носителей. Катионные липиды электростатически связываются с отрицательно заряженными молекулами ДНК или РНК, формируя липоплексы. Эти комплексы адсорбируются на клеточной мембране, поглощаются преимущественно путем эндоцитоза, после чего нуклеиновая кислота высвобождается в цитоплазму или, для экспрессии ДНК, поступает в ядро.
Эффективность липофекции зависит от соотношения реагента и нуклеиновой кислоты, размера образующихся комплексов, типа клеток, плотности клеточной культуры и времени экспозиции. Метод применяют для временной экспрессии плазмидной ДНК, малых интерферирующих РНК, мРНК и других конструкций, а при использовании селективных маркеров возможно получение стабильных трансфицированных клеточных линий. В отличие от обратной транскрипции, липофекция не является ферментативным синтезом ДНК на матрице РНК, а в отличие от кальций-фосфатного метода не требует образования осадка фосфата кальция.
Таким образом, оба названных реагента используются как коммерческие системы доставки генетического материала в эукариотические клетки. Их действие основано не на изменении последовательности нуклеиновой кислоты, а на повышении ее проникновения через клеточную мембрану и внутриклеточного высвобождения. Термин трансфекция применяют к введению чужеродной нуклеиновой кислоты в эукариотические клетки, тогда как трансформация чаще обозначает генетическое преобразование клеток или поглощение ДНК бактериями.
| Метод или процесс | Основной компонент | Механизм | Типичный результат | Отличительный признак |
|---|---|---|---|---|
| Липофекция | Катионные липиды или липидоподобные носители | Образование липоплексов, эндоцитоз и высвобождение ДНК или РНК в клетке | Временная либо стабильная экспрессия доставленного генетического материала | К этому подходу относятся Метафектен и Липофектамин |
| Кальций-фосфатная трансфекция | Растворы хлорида кальция и фосфатного буфера | Формирование микропреципитата ДНК с фосфатом кальция и его поглощение клетками | Экспрессия введенной ДНК | Не использует липидные комплексы; чувствительна к pH и условиям образования осадка |
| Электропорация | Кратковременный электрический импульс | Обратимое образование пор в плазматической мембране | Введение ДНК, РНК или белков в клетки | Необходима специальная аппаратура; возможна повышенная цитотоксичность |
| Обратная транскрипция | РНК-зависимая ДНК-полимераза — обратная транскриптаза | Синтез комплементарной ДНК на матрице РНК | Получение кДНК или промежуточной ДНК-формы ретровируса | Это молекулярно-биохимический процесс, а не способ доставки нуклеиновой кислоты |
| Бактериальная трансформация | Свободная экзогенная ДНК и компетентные бактериальные клетки | Поглощение бактерией чужеродной ДНК с последующей репликацией или рекомбинацией | Изменение генотипа бактерии, например приобретение устойчивости или селективного маркера | Термин преимущественно используется для прокариот, а не для липидной доставки в клетки млекопитающих |
При выборе системы липофекции оценивают восприимчивость клеточной линии, токсичность реагента и требуемую длительность экспрессии. Для малых РНК часто используют оптимизированные катионные липидные комплексы, тогда как для плазмидной ДНК дополнительно учитывают необходимость ядерного поступления. Контрольными показателями служат эффективность трансфекции, жизнеспособность клеток и специфичность экспрессии целевого продукта.