2) однонитевые разрывы ДНК
3) двунитевые разрывы ДНК
4) анеуплоидию в сперматозоидах
Электронная микроскопия сперматозоидов позволяет оценить их ультраструктуру, включая состояние ядерного хроматина. В ходе спермиогенеза гистоны в ядре сперматозоида замещаются протаминами, вследствие чего хроматин приобретает высокую степень компактности. При нарушении этого процесса выявляются участки разрыхления и неоднородной электронной плотности хроматина, а также другие признаки неправильной упаковки ядерного материала.
Метод дает преимущественно морфологическую и ультраструктурную информацию и не определяет непосредственно химические повреждения отдельных цепей ДНК. Однонитевые и двунитевые разрывы выявляют специализированными молекулярными методами: TUNEL, различными вариантами ДНК-комет-теста и другими методиками оценки фрагментации ДНК. Поэтому нарушение конденсации хроматина является прямым диагностическим результатом электронной микроскопии, тогда как фрагментация ДНК может быть лишь функционально связана с выявленными ультраструктурными изменениями.
Анеуплоидия представляет собой изменение числа хромосом в отдельном сперматозоиде и не может быть достоверно установлена по его ультраструктуре. Для этого применяют флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH) с хромосомоспецифичными зондами, реже — молекулярно-генетические методы. Таким образом, правильный ответ основан на способности электронной микроскопии непосредственно визуализировать степень и равномерность конденсации ядерного хроматина.
| Метод | Основной объект оценки | Диагностический результат |
|---|---|---|
| Электронная микроскопия | Ультраструктура ядра и хроматина сперматозоида | Выявление разрыхления, неоднородности и нарушения конденсации хроматина |
| TUNEL-тест | Свободные 3′-гидроксильные концы фрагментов ДНК | Оценка общей фрагментации ДНК; метод не всегда позволяет надежно различить однонитевые и двунитевые разрывы |
| ДНК-комет-тест в щелочных условиях | Повреждения ДНК, чувствительные к щелочной денатурации | Преимущественная оценка однонитевых разрывов и щелочелабильных участков, а также части двунитевых разрывов |
| ДНК-комет-тест в нейтральных условиях | Двунитевые разрывы ДНК | Преимущественная оценка двунитевых разрывов по степени миграции ДНК из нуклеоида |
| Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) | Число копий отдельных хромосом в сперматозоиде | Выявление анеуплоидии по избытку или недостатку сигналов для выбранных хромосом |
| SCSA и сходные тесты | Чувствительность хроматина к денатурации | Косвенная оценка повреждения и нестабильности хроматина, но не визуализация его ультраструктуры |
Нарушенная конденсация снижает защиту генома сперматозоида от действия окислительного стресса и может сопровождаться повышенной фрагментацией ДНК. Такие изменения потенциально связаны со снижением оплодотворяющей способности и неблагоприятными параметрами раннего эмбрионального развития. Электронная микроскопия особенно информативна при необходимости детального анализа тяжелых нарушений сперматогенеза и строения сперматозоидов. Для комплексной оценки мужского бесплодия ее результаты сопоставляют со спермограммой, тестами на фрагментацию ДНК и исследованием хромосомного набора методом FISH.