2) группы сцепления
3) крупные хромосомные перестройки
4) внутригенные и внегенные микросателлитные повторы в гене
MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) основан на гибридизации двух олигонуклеотидных зондов с соседними участками исследуемой ДНК. При полном совпадении последовательности зонды лигируются, после чего общий участок амплифицируется универсальными праймерами и количественно оценивается по интенсивности флуоресцентного сигнала. Снижение сигнала указывает на потерю копии участка, а увеличение — на его дупликацию, поэтому метод особенно эффективен для выявления делеций и дупликаций отдельных экзонов, нескольких экзонов или всего гена.
Точечные варианты могут выявляться с помощью MLPA только в ограниченных ситуациях: если известная замена нарушает связывание или лигирование зонда либо используется специально сконструированный аллель-специфичный зонд. Поэтому метод не предназначен для поиска любых неизвестных точечных мутаций; для этой задачи предпочтительны секвенирование по Сэнгеру или методы массового параллельного секвенирования. В рамках приведённой формулировки правильный ответ отражает возможность обнаружения определённых точечных вариантов в сочетании с количественной регистрацией протяжённых внутригенных делеций и дупликаций.
| Исследуемый объект | Возможности MLPA | Основной диагностический принцип или предпочтительный метод |
|---|---|---|
| Делеции экзонов | Надёжное выявление снижения дозы соответствующего участка | Сравнение нормализованной интенсивности сигнала с контрольными образцами |
| Дупликации экзонов | Выявление увеличения дозы генетического материала | Повышение относительного пикового сигнала при капиллярном электрофорезе |
| Известная точечная замена | Возможна при нарушении лигирования зонда или применении мутационно-специфичного зонда | Таргетный анализ; неизвестные варианты метод обычно не обнаруживает |
| Крупные хромосомные перестройки | Как правило, не характеризуются полностью и структурно | Кариотипирование, FISH, хромосомный микроматричный анализ или секвенирование |
| Микросателлитные повторы | Не являются основной мишенью MLPA | ПЦР с анализом длины фрагментов, фрагментный анализ или секвенирование повторов |
| Группы сцепления | Не определяются | Анализ родословных и полиморфных генетических маркеров для оценки совместного наследования |
Результат MLPA оценивают с учётом нормализации сигнала, качества контрольных проб и порогов, установленных лабораторным протоколом. Обнаруженная делеция или дупликация обычно требует подтверждения независимым методом, например количественной ПЦР, массивом или секвенированием с анализом числа копий. При подозрении на точечную мутацию отрицательный результат MLPA не исключает патогенный вариант, не влияющий на участок связывания зонда. Таким образом, MLPA является прежде всего методом анализа дозы генетического материала, дополненным возможностью таргетного выявления отдельных известных вариантов.