2) гибридизации молекулы ДНК с референсной последовательностью
3) определении последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК
4) различиях нуклеотидной последовательности молекулы ДНК в сайте узнавания для рестриктазы (+)
Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) выявляет различия ДНК, которые изменяют сайт узнавания рестриктазы — фермента, расщепляющего молекулу в строго определённой нуклеотидной последовательности. Однонуклеотидная замена может создать новый сайт рестрикции или, напротив, устранить существующий. После обработки исследуемой ДНК соответствующей рестриктазой образуются фрагменты различной длины, отражающие аллельные варианты анализируемого локуса.
Полученные фрагменты разделяют методом гель-электрофореза и идентифицируют с помощью специфического зонда при классическом RFLP-анализе либо оценивают непосредственно после амплификации при PCR-RFLP. Наличие одного, двух или нескольких фрагментов определённого размера позволяет установить генотип пациента. Таким способом выявляют известные патогенные варианты, сцепленные генетические маркеры и наследуемые полиморфизмы при условии, что изменение нуклеотидной последовательности влияет на рестрикционный профиль.
| Метод | Основной принцип | Тип выявляемых изменений | Ключевой диагностический признак |
|---|---|---|---|
| Классический RFLP | Рестрикция геномной ДНК, электрофорез и гибридизация с меченым зондом | Изменения сайтов рестрикции, вставки и делеции между ними | Различия длины гибридизующихся фрагментов |
| PCR-RFLP | Амплификация локуса с последующим расщеплением ампликона рестриктазой | Известные варианты, создающие или устраняющие сайт рестрикции | Характерный набор полос после электрофореза |
| Секвенирование | Прямое определение порядка нуклеотидов | Однонуклеотидные варианты и малые вставки или делеции | Непосредственное обнаружение изменённого нуклеотида |
| MLPA | Сравнительная амплификация лигированных зондов | Делеции и дупликации отдельных экзонов | Изменение относительной интенсивности сигнала |
| Матричная сравнительная геномная гибридизация | Сравнение гибридизации исследуемой и референсной ДНК | Протяжённые потери и увеличения числа копий участков генома | Снижение или повышение отношения флуоресцентных сигналов |
| FISH | Гибридизация флуоресцентного зонда с хромосомным локусом | Анеуплоидии, крупные перестройки и микроделеции | Изменение числа или расположения сигналов в клетке |
RFLP-анализ относится к методам непрямого определения генетических вариантов, поскольку оценивается не сама последовательность ДНК, а сформированный ею рестрикционный профиль. Метод обладает высокой специфичностью для заранее известного варианта, но требует правильного выбора рестриктазы и контрольных образцов. Если патогенная замена не изменяет естественный сайт рестрикции, в праймер может быть искусственно введено несовпадение, создающее диагностический сайт. В современной лабораторной генетике PCR-RFLP применяется преимущественно для недорогого исследования ограниченного числа известных вариантов.