2) спектральное кариотипирование хромосом
3) флуоресцентная in situ гибридизация
4) сравнительная геномная гибридизация (+)
Сравнительная геномная гибридизация (CGH) основана на конкурентном связывании исследуемой и референсной геномной ДНК, меченных различными флуорохромами. Обе ДНК-пробы одновременно гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами, а при матричной CGH — с упорядоченным набором ДНК-зондов на микрочипе. Соотношение интенсивности флуоресцентных сигналов отражает относительное число копий анализируемых участков генома.
Преобладание сигнала исследуемой ДНК указывает на дупликацию или амплификацию соответствующего локуса, а снижение сигнала — на делецию. Метод позволяет проводить полногеномный поиск несбалансированных хромосомных аномалий без предварительного выбора конкретного гена или участка. При этом CGH не выявляет сбалансированные транслокации и инверсии, поскольку они не сопровождаются изменением количества генетического материала; чувствительность к низкоуровневому мозаицизму также ограничена.
Классическая CGH имеет разрешение порядка нескольких мегабаз и в настоящее время во многом уступила место хромосомному микроматричному анализу, или array-CGH. Использование микроматриц значительно повышает разрешающую способность и позволяет обнаруживать субмикроскопические делеции и дупликации, лежащие в основе многих синдромов множественных врождённых пороков развития, задержки психомоторного развития и интеллектуальных нарушений.
| Метод | Основной принцип | Диагностические возможности | Ключевые ограничения |
|---|---|---|---|
| Классическая CGH | Конкурентная гибридизация меченых исследуемой и контрольной ДНК с метафазными хромосомами | Полногеномное выявление делеций, дупликаций и амплификаций | Относительно низкое разрешение; не выявляет сбалансированные перестройки |
| Array-CGH | Конкурентная гибридизация ДНК с зондами, фиксированными на микроматрице | Выявление субмикроскопических изменений числа копий участков ДНК | Не определяет большинство точечных мутаций и сбалансированных транслокаций |
| Флуоресцентная in situ гибридизация | Связывание локус-специфического флуоресцентного зонда с заданным участком хромосомы | Прицельная диагностика конкретной анеуплоидии, делеции или транслокации | Необходим предварительный выбор исследуемого локуса |
| Спектральное кариотипирование | Окрашивание каждой пары хромосом уникальной комбинацией флуорохромов | Выявление сложных и скрытых межхромосомных перестроек | Недостаточная чувствительность к малым внутрихромосомным делециям и дупликациям |
| Супрессионная in situ гибридизация | Подавление гибридизации повторяющихся последовательностей конкурентной немеченой ДНК | Повышение специфичности хромосомных и локус-специфических зондов | Является вспомогательным приёмом, а не методом полногеномной оценки числа копий |
| Стандартное кариотипирование | Микроскопический анализ дифференциально окрашенных метафазных хромосом | Определение анеуплоидий и крупных сбалансированных или несбалансированных перестроек | Не выявляет большинство субмикроскопических изменений |
Результаты CGH интерпретируют с учётом клинического фенотипа, размера выявленного изменения и расположенных в нём генов. Обнаруженный вариант числа копий может быть патогенным, вероятно патогенным, неопределённого клинического значения, вероятно доброкачественным или доброкачественным. Для уточнения происхождения изменения часто исследуют родителей пациента. При подозрении на моногенное заболевание с точечной мутацией требуется дополнение исследования методами секвенирования.