2) выявление числовых нарушений хромосом в интерфазных ядрах
3) выявление неоцентромерных регионов в сверхчисленных малых маркерных хромосомах
4) диагностика хромосомных инверсий
Супрессионная in situ-гибридизация применяется для визуализации уникальных или низкокопийных последовательностей ДНК на хромосомах. В составе гибридизационной смеси используют меченый специфический зонд и избыток немеченой повторяющейся ДНК, например Cot-1 DNA. Немеченый конкурент блокирует связывание зонда с многочисленными диспергированными и сателлитными повторами, благодаря чему снижается фоновый сигнал и повышается специфичность выявления локуса.
Этот принцип особенно важен при использовании зондов, полученных из больших геномных фрагментов, искусственных хромосом или библиотек, содержащих наряду с уникальными участками повторяющиеся последовательности. Метод позволяет картировать локализацию генов и небольших хромосомных сегментов, а также обнаруживать микроделеции, дупликации и другие структурные изменения, если целевая последовательность имеет низкую представленность в геноме. Числовые аномалии в интерфазных ядрах обычно выявляют стандартной интерфазной FISH с центромерными или локус-специфичными зондами, а не относят к специфической области супрессии повторов.
| Метод или вариант исследования | Основной объект выявления | Принцип и диагностический признак |
|---|---|---|
| Супрессионная in situ-гибридизация | Уникальные и низкокопийные последовательности | Конкурентное блокирование повторяющейся ДНК немеченым блокатором; специфический сигнал сохраняется в области целевого локуса |
| Интерфазная FISH | Числовые нарушения хромосом | Подсчет сигналов локус- или центромерных зондов в ядрах; например, три сигнала указывают на трисомию соответствующей хромосомы |
| Центромерная FISH и иммунно-FISH | Неоцентромеры и атипичные центромерные области | Оценивают наличие альфа-сателлитной ДНК и белков центромеры, прежде всего CENP-A; неоцентромера может быть функциональной при отсутствии типичного альфа-сателлитного массива |
| FISH с зондами, фланкирующими точки разрыва | Хромосомные инверсии | Изменение взаимного расположения или разделение сигналов по обе стороны точки разрыва подтверждает структурную перестройку |
| Хромосомный painting | Крупные транслокации и маркерные хромосомы | Окрашивание всей хромосомы или ее значительной части позволяет определить происхождение крупного дополнительного материала |
| Кариотипирование | Числовые и крупные структурные аномалии | Оценивает метафазные хромосомы, но имеет более низкое разрешение по сравнению с локус-специфической FISH и молекулярно-цитогенетическими методами |
Таким образом, ключевым диагностическим преимуществом супрессионной гибридизации является устранение неспецифического связывания с повторяющимися участками генома. Это делает метод пригодным для анализа небольших или редко представленных хромосомных последовательностей. Выбор конкретной разновидности FISH определяется размером предполагаемого нарушения, его локализацией и необходимостью оценивать число копий, структуру хромосомы или функциональность центромеры.