2) последовательное дифференциальное окрашивание метафазных хромосом и флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомном препарате
3) второй раунд гибридизации in situ с набором дополнительных ДНК-зондов для выявления и характеристики множественных хромосомных аберраций в кариотипе
4) вариант гибридизации in situ с использованием зондов, полученных на основе микродиссекционных ДНК-библиотек (+)
Обратное окрашивание хромосом, или reverse chromosome painting, представляет собой разновидность флуоресцентной гибридизации in situ, при которой ДНК-зонд получают непосредственно из исследуемого аномального хромосомного материала методом микродиссекции. Выделенный участок амплифицируют, метят флуорохромом и гибридизуют с нормальными метафазными хромосомами. Локализация флуоресцентных сигналов позволяет установить, из каких хромосом и хромосомных сегментов сформирована неизвестная маркерная или структурно перестроенная хромосома.
Метод особенно информативен при сложных транслокациях, инсерциях, дополнительных маркерных хромосомах и других аберрациях, происхождение которых невозможно уверенно определить стандартным дифференциальным окрашиванием. Термин обратное отражает направление исследования: при обычном хромосомном пейнтинге известный зонд наносят на исследуемый кариотип, тогда как при обратном окрашивании неизвестный хромосомный фрагмент превращают в зонд и исследуют его соответствие нормальному набору хромосом.
| Метод | Исследовательский принцип | Основное диагностическое применение |
|---|---|---|
| Стандартное дифференциальное окрашивание | Формирование характерного рисунка полос метафазных хромосом | Выявление числовых аномалий и крупных структурных перестроек |
| Локус-специфическая FISH | Гибридизация зонда с определённой последовательностью ДНК | Подтверждение конкретной делеции, дупликации, транслокации или амплификации |
| Хромосомный пейнтинг | Использование набора зондов, специфичных для известной хромосомы | Определение участия выбранной хромосомы в структурной перестройке |
| Обратное окрашивание | Создание зонда из микродиссецированного неизвестного хромосомного материала | Установление происхождения маркерных хромосом и сложных аберрантных сегментов |
| Многоцветная FISH или SKY | Одновременное кодирование каждой пары хромосом отдельной комбинацией флуорохромов | Анализ множественных межхромосомных перестроек в одном кариотипе |
| Сравнительная геномная гибридизация | Сопоставление интенсивности гибридизации исследуемой и контрольной ДНК | Поиск несбалансированных потерь и увеличения числа копий геномных участков |
Обратное окрашивание характеризует состав аномальной хромосомы, но не всегда обеспечивает точное определение границ перестройки на уровне отдельных генов. Его разрешающая способность зависит от размера микродиссецированного фрагмента, качества ДНК-библиотеки и условий гибридизации. Для детального уточнения точек разрыва результаты могут дополняться локус-специфической FISH, хромосомным микроматричным анализом или молекулярно-генетическими методами. Комплексный подход позволяет корректно описать аберрацию и оценить её возможное клиническое значение.