2) однонуклеотидную замену в ДНК
3) одноцепочечный разрыв в ДНК
4) двуцепочечный разрыв в ДНК (+)
Оригинальный Cas9 является РНК-направляемой эндонуклеазой: в комплексе с направляющей РНК он распознаёт комплементарную последовательность ДНК при наличии соседнего PAM-сайта. В активном белке функционируют два каталитических домена — HNH, расщепляющий цепь, комплементарную направляющей РНК, и RuvC, расщепляющий противоположную цепь. Одновременная работа этих доменов приводит к формированию двуцепочечного разрыва ДНК, обычно примерно за 3 нуклеотида до PAM-сайта.
Поэтому верным является вариант, указывающий на двуцепочечный разрыв. Сам Cas9 не осуществляет направленную однонуклеотидную замену: после разреза клетка репарирует повреждение преимущественно посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), что может вызывать небольшие вставки или делеции, либо посредством гомологичной рекомбинации (HDR) при наличии донорной матрицы. Одноцепочечный разрыв характерен для специально модифицированного никказного Cas9, у которого инактивирован один из каталитических доменов.
| Система | Каталитическая активность | Тип воздействия на ДНК | Основной результат |
|---|---|---|---|
| Оригинальный Cas9 с направляющей РНК | Активны домены HNH и RuvC | Разрыв обеих цепей | Индукция NHEJ или HDR; возможны делеции, вставки или точное редактирование по матрице |
| Cas9-никказа | Активен только один каталитический домен | Разрыв одной цепи | Ник; при использовании пары никказ возможно более селективное формирование двуцепочечного разрыва |
| Цитидиновый или аденозиновый базовый редактор | Cas9-белок обычно представлен никказой, связанной с дезаминазой | Контролируемая модификация основания без классического двуцепочечного разрыва | Переходы C→T или A→G в пределах окна редактирования |
| Прайм-редактор | Никказа Cas9 в комплексе с обратной транскриптазой | Одноцепочечный разрыв и запись новой последовательности | Точечные замены, небольшие вставки или делеции без обязательного двуцепочечного разрыва |
| NHEJ после разреза Cas9 | Репарация без донорной матрицы | Соединение концов двуцепочечного разрыва | Небольшие инсерции и делеции; часто используется для инактивации гена |
| HDR после разреза Cas9 | Репарация с использованием гомологичной донорной последовательности | Точное восстановление или замена участка | Введение заданной последовательности, но эффективность зависит от типа клетки и условий эксперимента |
Формирование двуцепочечного разрыва требует не только наличия Cas9, но и соответствующей направляющей РНК и доступного PAM-сайта. Специфичность редактирования определяется комплементарностью направляющей последовательности и контролируется также анализом потенциальных off-target-разрезов. Биологический эффект зависит от выбранного пути репарации: NHEJ чаще приводит к небольшим инсерциям и делециям, а HDR позволяет внести заданную генетическую последовательность. Таким образом, тип повреждения определяется конструкцией редактора, а не только фактом связывания Cas9 с ДНК.