2) демеколцина
3) гидроксида бария
4) митомицина C
Для получения препаратов прометафазных хромосом используют бромистый этидий (этидиум бромид). Это интеркалирующий агент, который в контролируемой концентрации изменяет топологию ДНК и ослабляет степень конденсации хроматина. В результате формируются более длинные и тонкие хромосомы ранней митотической стадии, на которых выявляется большее число полос; такой материал применяют для кариотипирования высокого разрешения и поиска небольших структурных перестроек.
Демеколцин связывается с тубулином и нарушает образование веретена деления, поэтому преимущественно используется для митотической остановки клеток на стадии метафазы с максимально конденсированными хромосомами. Гидроксид бария применяют после фиксации для обработки препаратов при C-дифференциальном окрашивании, а митомицин C вызывает межцепочечные сшивки ДНК и хромосомные повреждения; его используют при оценке хромосомной нестабильности, в частности при подозрении на анемию Фанкони. Эти вещества не обеспечивают получение типичного прометафазного материала.
| Агент или этап | Основной механизм | Результат в цитогенетическом исследовании | Типичное применение |
|---|---|---|---|
| Бромистый этидий | Интеркаляция в ДНК, изменение топологии и частичная деконденсация хроматина | Удлиненные, менее конденсированные прометафазные хромосомы | Кариотипирование высокого разрешения, выявление мелких перестроек |
| Демеколцин | Нарушение полимеризации микротрубочек веретена деления | Накопление клеток в митозе, преимущественно в метафазе | Получение стандартных метафазных препаратов |
| Гидроксид бария | Щелочная денатурация ДНК и избирательная обработка гетерохроматина | Выявление интенсивно окрашиваемых центромерных участков | C-бэндинг, исследование конститутивного гетерохроматина |
| Митомицин C | Образование ковалентных сшивок между цепями ДНК | Хромосомные разрывы, радиальные конфигурации и другие признаки нестабильности | Тестирование при подозрении на синдром хромосомной нестабильности |
| Метотрексат с последующим добавлением тимидина | Синхронизация клеточного цикла за счёт блока синтеза тимидилата и последующего выхода из блока | Синхронное прохождение клетками митотических стадий | Повышение доли клеток с прометафазными и раннеметафазными хромосомами |
| G-дифференциальное окрашивание | Обработка трипсином и окрашивание по Гимзе с формированием полосатого рисунка | Воспроизводимый рисунок G-полос на каждой хромосоме | Идентификация хромосом и структурных аномалий |
Прометафазный анализ отличается более высокой разрешающей способностью по сравнению со стандартным метафазным кариотипированием. Качество препарата зависит от концентрации бромистого этидия и длительности воздействия: недостаточная обработка не обеспечивает необходимого удлинения, а чрезмерная приводит к избыточной деконденсации и ухудшению морфологии. Интерпретация результатов проводится с учётом качества полосатого рисунка и требований международной номенклатуры ISCN. Поэтому именно бромистый этидий соответствует принципу получения удлиненных прометафазных хромосом.