2) Саузерн-блот
3) QT-ПЦР
4) секвенирование полного генома
ПДРФ-анализ (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, PCR-RFLP) является простым и доступным методом выявления заранее известных частых мутаций митохондриальной ДНК. Исследуемый участок сначала амплифицируют методом ПЦР, затем обрабатывают рестриктазой — ферментом, который узнаёт определённую последовательность нуклеотидов и разрезает ДНК. Точечная мутация может создать или, наоборот, устранить сайт рестрикции, поэтому после электрофоретического разделения фрагментов мутантный и нормальный варианты имеют различный характер полос.
Метод особенно удобен для таргетного скрининга распространённых патогенных вариантов, когда мутация уже известна и влияет на сайт рестрикции либо выявляется с помощью специально подобранной рестриктазы. При митохондриальных заболеваниях важно учитывать гетероплазмию — сосуществование мутантных и нормальных копий митохондриальной ДНК; соотношение аллелей влияет на чувствительность анализа и может различаться в крови, моче, мышечной ткани и эпителии. Саузерн-блот преимущественно применяют для крупных делеций и перестроек, количественная ПЦР — для оценки количества копий или таргетного выявления варианта с зондами, а полногеномное секвенирование является более сложным и дорогостоящим подходом.
| Метод | Основная диагностическая задача | Принцип и ограничения |
|---|---|---|
| ПДРФ-анализ | Выявление известных частых точечных мутаций | ПЦР с последующей рестрикцией и электрофорезом; эффективен, если вариант изменяет сайт рестрикции |
| Аллель-специфическая ПЦР | Таргетное обнаружение конкретной нуклеотидной замены | Используются праймеры, комплементарные нормальному или мутантному аллелю; требует предварительного знания варианта |
| Количественная ПЦР в реальном времени | Определение количества митохондриальной ДНК и относительной доли варианта | Высокая скорость и чувствительность, но необходимы специфические флуоресцентные зонды или калибровочные системы |
| Саузерн-блот | Поиск крупных делеций, дупликаций и перестроек митохондриального генома | Позволяет оценивать размер и относительное количество аномальных молекул; метод трудоёмок и менее удобен для точечных замен |
| Секвенирование митохондриального генома | Поиск неизвестных или множественных вариантов | Определяет нуклеотидную последовательность, но требует биоинформатической обработки и подтверждения клинической значимости находки |
| Гетероплазмия | Оценка соотношения мутантных и нормальных митохондриальных геномов | Низкая доля мутации может быть не выявлена в крови; при подозрении используют более информативную ткань и высокочувствительный метод |
Результат ПДРФ-анализa интерпретируют по профилю рестрикционных фрагментов: наличие нормального и мутантного наборов полос может указывать на гетероплазмию. При отрицательном результате клиническое подозрение не исключается, особенно если мутация представлена в низкой доле или отсутствует в исследованной ткани. Для подтверждения спорных результатов применяют прямое секвенирование или высокочувствительное таргетное исследование. Выбор биологического материала должен учитывать возраст пациента, фенотип и тканеспецифичность распределения митохондриального варианта.