2) термолабильной ДНК-полимеразы
3) термостабильной ДНК-полимеразы (+)
4) РНК-полимеразы
Ключевым условием практического применения полимеразной цепной реакции стало использование термостабильной ДНК-полимеразы, первоначально выделенной из бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимеразы). В каждом цикле ПЦР ДНК-матрица подвергается денатурации при высокой температуре, после чего праймеры присоединяются к комплементарным участкам, а фермент достраивает новые цепи ДНК. Термостабильная полимераза сохраняет активность после многократного нагревания, поэтому процесс можно автоматизировать в термоциклере.
При использовании обычной термолабильной ДНК-полимеразы фермент денатурировал бы во время стадии разделения цепей, и его пришлось бы добавлять заново после каждого цикла. Стабильность Taq-полимеразы обеспечивает экспоненциальное накопление специфического фрагмента: теоретически количество амплифицированной ДНК удваивается в каждом цикле. Современные высокоточные термостабильные полимеразы дополнительно обладают 3′→5′-экзонуклеазной корректирующей активностью, что уменьшает частоту ошибок.
| Фермент | Основной субстрат | Термостабильность | Основная функция | Значение для ПЦР |
|---|---|---|---|---|
| Taq-ДНК-полимераза | ДНК-матрица и дезоксирибонуклеотиды | Высокая | Синтез комплементарной цепи ДНК при повышенной температуре | Обеспечивает многократное повторение циклов без замены фермента |
| Высокоточная термостабильная ДНК-полимераза, например Pfu | ДНК-матрица и дезоксирибонуклеотиды | Высокая | Синтез ДНК с 3′→5′-корректирующей активностью | Применяется, когда особенно важна низкая частота мутаций |
| Термолабильная ДНК-полимераза, например фрагмент Кленова | ДНК-матрица и дезоксирибонуклеотиды | Низкая | Синтез ДНК при умеренной температуре | Инактивируется при денатурации и непригодна для стандартной циклической ПЦР без повторного добавления |
| Обратная транскриптаза | РНК-матрица | Вариабельная; существуют термостабильные формы | Синтез ДНК на матрице РНК | Используется на этапе обратной транскрипции в ОТ-ПЦР, но не заменяет ДНК-полимеразу амплификационного этапа |
| РНК-полимераза | ДНК-матрица | Не является определяющим свойством для ПЦР | Синтез молекулы РНК по ДНК-матрице | Не катализирует амплификацию ДНК в классической ПЦР |
| Теломераза | Концевые участки хромосом | Не предназначена для циклического нагревания | Удлинение теломер с использованием собственной РНК-матрицы | Не участвует в стандартной амплификации заданного фрагмента ДНК |
Таким образом, открытие термостабильной ДНК-полимеразы превратило ПЦР в быстрый и воспроизводимый метод молекулярной диагностики. Специфичность реакции определяется последовательностями праймеров, а эффективность — составом реакционной смеси и условиями температурного профиля. ПЦР применяется для выявления патогенных микроорганизмов, генетических вариантов, мутаций и оценки экспрессии генов после этапа обратной транскрипции. Выбор полимеразы зависит от требуемой скорости, длины ампликона и допустимой частоты ошибок.