2) открыта у бактерий (+)
3) разработана биофизиками
4) открыта в клетках человека
Верным является утверждение, что система CRISPR/Cas9 открыта у бактерий. CRISPR-локусы представляют собой участки генома прокариот с повторяющимися последовательностями, между которыми расположены уникальные спейсеры, происходящие, как правило, из геномов ранее проникших бактериофагов или плазмид. Вместе с белками Cas они формируют адаптивную иммунную систему бактерий и архей, обеспечивающую распознавание и уничтожение чужеродной нуклеиновой кислоты.
В природном механизме CRISPR/Cas9 фрагмент чужеродной ДНК встраивается в CRISPR-массив и используется для синтеза направляющей РНК. Комплекс crRNA и tracrRNA направляет эндонуклеазу Cas9 к комплементарному участку ДНК; для белка Cas9 из Streptococcus pyogenes необходимо наличие соседнего мотива PAM, обычно NGG. После распознавания мишени Cas9 формирует двунитевой разрыв ДНК, расположенный приблизительно за три нуклеотида до PAM.
Современная технология редактирования генома возникла вследствие лабораторной адаптации природной бактериальной системы, а не была изначально разработана синтетическими биологами или обнаружена в клетках человека. В инженерном варианте crRNA и tracrRNA обычно объединяют в единую направляющую РНК — sgRNA, что позволяет программировать мишень Cas9 изменением ее последовательности. Дальнейшая репарация разрыва по механизму негомологичного соединения концов может приводить к инсерциям и делециям, а репарация с использованием донорной матрицы — к точной замене или вставке последовательности.
| Компонент или признак | Природная бактериальная система | Инженерное применение |
|---|---|---|
| Биологическое происхождение | Геномные локусы бактерий и архей, участвующие в защите от мобильных генетических элементов | Модифицированная платформа для направленного редактирования геномов клеток |
| CRISPR-массив | Чередование повторов и спейсеров, приобретенных из чужеродной ДНК | Природный массив не требуется; информация о мишени задается синтетической направляющей РНК |
| Направляющая РНК | Комплекс crRNA и tracrRNA распознает последовательность чужеродной ДНК | Чаще используется единая sgRNA, содержащая участок комплементарности к выбранной мишени |
| Эффекторный белок | Cas9 связывает направляющую РНК и расщепляет целевую ДНК | Cas9 или ее модифицированные варианты применяются для нокаута, точечных замен и регуляции экспрессии |
| Требование к PAM | Необходимо для правильного связывания и активации Cas9 рядом с мишенью | Ограничивает выбор доступных участков и учитывается при проектировании sgRNA |
| Тип генетического повреждения | Двунитевой разрыв чужеродной ДНК с последующей ее инактивацией | Разрыв используется для получения инделов, точной коррекции или вставки генетической последовательности |
| Биологический результат | Иммунологическая память прокариот по отношению к ранее встречавшемуся агенту | Целенаправленное изменение генома, в том числе в клетках человека, при контроле внецелевых эффектов |
Для клинической генетики важно различать исходную бактериальную систему и созданную на ее основе технологию редактирования генома. Возможность редактировать ДНК человека не означает, что CRISPR/Cas9 имеет человеческое происхождение. При оценке терапевтических применений учитывают специфичность направляющей РНК, внецелевое редактирование, мозаицизм, эффективность доставки компонентов и характер репарации ДНК. Эти параметры определяют безопасность и потенциальную клиническую применимость метода.