2) энхансерами и сайленсерами сплайсинга (+)
3) мотивами
4) сайтами связывания транскрипционных факторов
Экзонные энхансеры и сайленсеры сплайсинга (ESE и ESS) представляют собой цис-регуляторные последовательности внутри экзонов, которые определяют, будет ли данный экзон распознан и включён в зрелую мРНК. ESE преимущественно связывают белки семейства SR и усиливают рекрутирование компонентов сплайсосомы к прилежащим 5′- и 3′-сайтам сплайсинга. ESS взаимодействуют главным образом с репрессорными факторами, включая белки семейства hnRNP, и ограничивают включение экзона либо способствуют его пропуску.
Нарушение последовательности ESE или ESS способно изменить альтернативный сплайсинг даже при сохранности канонических донорного и акцепторного сайтов. Патогенный вариант может привести к пропуску экзона, активации криптического сайта сплайсинга, включению псевдоэкзона или появлению преждевременного стоп-кодона с последующей деградацией транскрипта посредством nonsense-mediated decay. Поэтому при интерпретации вариантов, расположенных в экзоне, учитывают не только изменение аминокислотной последовательности, но и потенциальное влияние на сплайсинг; при необходимости используют анализ РНК, минигенные тесты и предсказательные программы.
Указание на энхансеры и сайленсеры является более точным, чем общее обозначение мотивы : мотив — это лишь характерный участок нуклеотидной последовательности, не обязательно имеющий установленную функциональную роль. Канонические сайты сплайсинга находятся преимущественно на границах экзон–интрон, тогда как экзонные регуляторные элементы могут располагаться на значительном расстоянии от этих границ и действуют через связывание регуляторных белков.
| Элемент | Типичная локализация | Основные взаимодействующие факторы | Функциональный эффект | Возможное последствие варианта |
|---|---|---|---|---|
| Экзонный энхансер сплайсинга (ESE) | Внутри экзона | Белки SR и другие активаторы сплайсинга | Усиление распознавания экзона и сборки сплайсосомы | Пропуск экзона, снижение уровня нормальной мРНК |
| Экзонный сайленсер сплайсинга (ESS) | Внутри экзона | Чаще белки hnRNP и другие репрессоры | Подавление включения экзона или изменение выбора сайта сплайсинга | Аберрантное включение либо исключение экзона |
| 5′-сайт сплайсинга | Граница экзон–интрон со стороны интрона | U1 snRNP и вспомогательные факторы | Распознавание донорного участка и начало удаления интрона | Пропуск экзона, использование криптического сайта |
| 3′-сайт сплайсинга | Конец интрона перед экзоном | U2AF и другие компоненты сплайсосомы | Формирование акцепторного участка перед включаемым экзоном | Нарушение присоединения экзона к зрелой мРНК |
| Точка ветвления и полипиримидиновый тракт | Внутри интрона, перед 3′-сайтом | U2 snRNP, U2AF и вспомогательные белки | Образование лариатной структуры и корректное удаление интрона | Аномальный сплайсинг при интронных вариантах |
| Сайты связывания транскрипционных факторов | Промоторы, энхансеры и другие регуляторные области ДНК | Транскрипционные факторы и коактиваторы | Регуляция транскрипции, а не непосредственное распознавание экзона сплайсосомой | Изменение уровня транскрипции гена |
При подозрении на дефект экзонного регуляторного элемента окончательная оценка клинической значимости должна опираться на совокупность данных: частоту варианта в популяции, фенотип пациента, результаты функциональных исследований и данные о сохранности транскрипта. Один только прогноз in silico не подтверждает патогенность варианта. Особенно информативен анализ РНК из релевантной ткани, поскольку эффект сплайсинга может быть тканеспецифичным. В классификации вариантов такие изменения могут первоначально относиться к неопределённым, а после получения функциональных доказательств — быть переклассифицированы в патогенные или вероятно патогенные.