2) разрушение нуклеиновых кислот после выделения
3) разрушение нуклеиновых кислот в биообразце
4) контаминацию в процессе выделения между образцами (+)
Ложноотрицательный результат возникает, когда целевая нуклеиновая кислота присутствует в исходном биоматериале, но не обнаруживается в исследуемой пробе. К этому приводят недостаточный выход при лизисе и очистке, адсорбция ДНК или РНК на стенках пробирки, деградация матрицы в биообразце вследствие неправильного хранения, действия нуклеаз или многократного замораживания и оттаивания. Аналогичный эффект возможен при разрушении выделенного экстракта до этапа амплификации, а также при переносе ингибиторов ПЦР или ОТ-ПЦР.
Перенос материала между образцами при нарушении противоэпидемического и лабораторного режима обычно означает контаминацию нуклеиновыми кислотами из положительной пробы. Такая ошибка приводит к появлению мишени там, где её не было, то есть к ложноположительному результату, и поэтому не относится к причинам ложноотрицательного ответа. Исключением может быть загрязнение ингибирующими веществами, однако это уже действие ингибитора на реакцию амплификации, а не межобразцовая контаминация как таковая. Для контроля этапа выделения применяют отрицательный контроль экстракции, положительный контроль и внутренний контроль, позволяющий выявить потерю материала или ингибирование реакции.
| Фактор | Механизм | Ожидаемый результат | Профилактика или контроль |
|---|---|---|---|
| Неполный лизис и недостаточная эффективность выделения | Целевая ДНК или РНК остаётся в клеточном дебриси либо теряется при переносе и очистке | Ложноотрицательный результат или сигнал ниже порога обнаружения | Валидация метода, соблюдение времени инкубации, внутренний контроль выделения |
| Деградация нуклеиновых кислот в биообразце | Действие эндогенных нуклеаз, нарушение температурного режима или длительное хранение | Снижение концентрации и фрагментация мишени, ложноотрицательный результат | Правильный преаналитический этап, стабилизация и соблюдение сроков доставки |
| Разрушение выделенного экстракта | Повторные циклы замораживания и оттаивания, действие нуклеаз, неправильное хранение | Отсутствие амплифицируемой матрицы | Аликвотирование, хранение при регламентированной температуре, ограничение времени до анализа |
| Перенос ингибиторов из образца | Гемоглобин, соли, этанол, полисахариды и другие примеси подавляют полимеразную реакцию | Ложноотрицательный или недостоверный результат при наличии мишени | Дополнительная очистка, внутренний контроль амплификации |
| Низкая концентрация мишени или неадекватный забор материала | Количество копий ниже аналитической чувствительности метода либо материал не содержит поражённой ткани | Нестабильный сигнал, особенно около предела обнаружения | Корректный забор, достаточный объём и повторное исследование при клинических показаниях |
| Межобразцовая контаминация нуклеиновыми кислотами | Перенос ДНК или РНК из положительного образца в отрицательный | Ложноположительный результат, а не ложноотрицательный | Раздельные зоны, одноразовые наконечники с фильтрами, отрицательные контроли |
Интерпретация отрицательного результата должна учитывать качество образца, внутренний контроль и клиническую вероятность заболевания. Отсутствие сигнала при невалидном внутреннем контроле не подтверждает отсутствие генетического материала и требует повторного исследования. Если отрицательный результат не соответствует клиническим данным, показаны повторный забор материала, альтернативный метод выделения или исследование другой биологической среды. Контроль контаминации прежде всего защищает специфичность теста и предотвращает ложноположительные заключения.