2) рекомбинантная ДНК (+)
3) продукты распада экспрессированного белка
4) информационная РНК
Мишенью ПЦР в реальном времени при выявлении генетически модифицированных компонентов служит рекомбинантная ДНК, содержащая трансгенную последовательность или участок искусственно сформированной генетической конструкции. В диагностическом анализе амплифицируют короткий специфичный фрагмент ДНК, например последовательность вставленного гена, регуляторный элемент либо границу интеграции трансгена в геном организма. Накопление ампликона регистрируется по флуоресцентному сигналу, а значение порогового цикла (Ct) позволяет судить о наличии и, при использовании калибровочной кривой, о количественном содержании генетически модифицированного материала.
Белок, кодируемый трансгеном, является мишенью иммунологических и некоторых биохимических методов, но не ПЦР. Информационная РНК может исследоваться методом обратной транскрипции с последующей ПЦР (ОТ-ПЦР), однако для стандартного выявления ГМО в пищевой продукции она не является непосредственным объектом анализа. Продукты распада белка также не содержат специфической нуклеотидной последовательности, необходимой для амплификации. ДНК обычно более устойчива при хранении и технологической обработке, чем РНК и белки, хотя при интенсивном нагревании или гидролизе она может фрагментироваться; поэтому выбирают короткие ампликоны и используют внутренний контроль пригодности образца.
В практике различают скрининговую и событийно-специфическую ПЦР. Скрининг выявляет общие элементы генетических конструкций, например промотор или терминатор, а событийно-специфический анализ подтверждает конкретное место встраивания рекомбинантной последовательности и позволяет идентифицировать определённую линию ГМ-организма. Для достоверного результата необходимы отрицательный и положительный контроли, контроль ингибирования реакции и соблюдение мер против контаминации ампликонами.
| Объект или подход | Что выявляется | Основной метод | Диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Рекомбинантная ДНК | Трансген, регуляторный элемент или участок стыка вставка–геном | ПЦР в реальном времени | Непосредственное выявление генетически модифицированного материала |
| Экспрессированный белок | Антигенный продукт трансгена | ИФА, иммуноблоттинг, иммунохроматографический тест | Подтверждает наличие белкового продукта, но не является мишенью обычной ПЦР |
| Информационная РНК | Транскрипт соответствующего гена | ОТ-ПЦР или количественная ОТ-ПЦР | Оценивает экспрессию гена; РНК менее стабильна и требует обратной транскрипции |
| Скрининговая ПЦР | Общие элементы типичных генетических конструкций | ПЦР с праймерами к промотору, терминатору или маркеру | Предварительное обнаружение возможного ГМО, обычно без точной идентификации события |
| Событийно-специфическая ПЦР | Уникальная граница интеграции трансгена | ПЦР с праймерами, расположенными по обе стороны участка вставки | Идентификация конкретной ГМ-линии и подтверждение результата скрининга |
| Количественная оценка | Количество копий целевой последовательности относительно видоспецифичной ДНК | Реал-тайм ПЦР, Ct и калибровочная кривая | Расчёт доли ГМ-компонента при наличии валидированных стандартов и контролей |
Положительный сигнал ПЦР свидетельствует о присутствии специфической нуклеотидной последовательности, но сам по себе не характеризует содержание белка или его биологическую активность. Отрицательный результат интерпретируют только при подтверждённой сохранности ДНК и отсутствии ингибирования реакции. При высоко переработанной продукции целесообразно использовать короткие амплифицируемые фрагменты и подтверждать находку альтернативной или событийно-специфической системой праймеров.