2) щелочной гидролиз объекта
3) кислотный гидролиз объекта (+)
4) прямую экстракцию хлороформом
В моче морфин преимущественно присутствует не только в свободной форме, но и в виде водорастворимых конъюгатов, главным образом морфин-3-глюкуронида и морфин-6-глюкуронида. Эти соединения обладают высокой полярностью и практически не переходят в органическую фазу при обычной экстракции. Кислотный гидролиз расщепляет гликозидную связь конъюгатов и высвобождает свободный морфин, вследствие чего увеличивается количество аналита, доступного для последующего извлечения.
После завершения гидролиза экстракционную смесь обычно подщелачивают. Морфин является слабым органическим основанием; в щелочной среде возрастает доля его неионизированной формы, которая лучше распределяется между водной и органической фазами и может быть извлечена, например, хлороформом. Таким образом, кислотный гидролиз повышает суммарную извлекаемость за счёт перевода связанных метаболитов в свободную форму, а последующее подщелачивание создаёт оптимальные условия для жидкостно-жидкостной экстракции.
| Компонент или этап | Химическое состояние | Влияние на экстракцию | Практическое значение |
|---|---|---|---|
| Свободный морфин | Слабое органическое основание; соотношение ионизированной и неионизированной форм зависит от pH | В щелочной среде лучше переходит в органическую фазу | Может быть непосредственно определён после подщелачивания и экстракции |
| Морфин-глюкурониды | Полярные конъюгаты, хорошо растворимые в воде | При прямой экстракции органическим растворителем в основном остаются в водной фазе | Без предварительного гидролиза возможно существенное занижение результата |
| Кислотный гидролиз | Расщепление связи между морфином и глюкуроновой кислотой | Увеличивает концентрацию свободного морфина в гидролизате | Основной этап подготовки мочи для более полного извлечения дериватов морфина |
| Щелочная среда после гидролиза | Преобладает неионизированная форма морфина | Повышается коэффициент распределения в пользу органического растворителя | Необходима для эффективной последующей экстракции |
| Прямая экстракция хлороформом | Извлекается преимущественно свободная, неионизированная фракция | Не обеспечивает полного извлечения конъюгированных форм | Подходит для оценки свободного морфина, но не всей его суммарной фракции |
| Настаивание с этанолом | Экстракция растворимых веществ без целенаправленного расщепления конъюгатов | Не устраняет высокую полярность глюкуронидов | Не является оптимальным способом повышения степени извлечения морфиновых метаболитов |
Выбор кислотного гидролиза основан на необходимости учитывать суммарное содержание свободного морфина и его конъюгированных метаболитов. Метод особенно важен при токсикологическом исследовании мочи, поскольку период циркуляции свободного вещества короче, чем время сохранения его метаболитов. Результат анализа после гидролиза следует интерпретировать с учётом условий пробоподготовки и возможной деградации термолабильных соединений. Для подтверждения обнаружения морфина применяют специфичные инструментальные методы, прежде всего газовую или жидкостную хроматографию с масс-спектрометрическим детектированием.