2) аффинная (+)
3) гель-фильтрационная
4) адсорбционная
Аффинная хроматография обладает наиболее высокой избирательностью, поскольку разделение основано на специфическом биологическом или химическом взаимодействии между целевой молекулой и иммобилизованным на неподвижной фазе лигандом. В качестве таких пар могут выступать антиген–антитело, фермент–субстрат или ингибитор, рецептор–лиганд, белок–кофактор. Благодаря принципу молекулярного распознавания из сложной смеси преимущественно удерживается именно вещество, способное специфически связываться с выбранным лигандом.
После удаления несвязавшихся компонентов целевое соединение элюируют, изменяя условия, нарушающие специфическое взаимодействие, например pH, ионную силу или концентрацию конкурирующего лиганда. Поэтому аффинная хроматография часто обеспечивает высокую степень очистки уже за один этап и широко применяется для выделения белков, ферментов, антител и других биомолекул. Другие виды хроматографии используют более общие физико-химические свойства веществ — заряд, размер молекул или способность к неспецифической адсорбции, поэтому обычно обладают меньшей селективностью по отношению к конкретному аналиту.
| Метод хроматографии | Основной принцип разделения | Определяющее свойство вещества | Характер избирательности |
|---|---|---|---|
| Аффинная | Специфическое связывание с иммобилизованным лигандом | Молекулярное сродство к определённому партнеру | Очень высокая, вплоть до селективного выделения конкретной молекулы |
| Ионообменная | Обратимое электростатическое взаимодействие с заряженной матрицей | Суммарный электрический заряд молекулы при данном pH | Высокая, но несколько веществ с близким зарядом могут удерживаться одновременно |
| Гель-фильтрационная | Разделение при прохождении через пористую матрицу | Гидродинамический размер и молекулярная масса | Умеренная; специфического распознавания молекулы нет |
| Адсорбционная | Различная степень сорбции компонентов на поверхности неподвижной фазы | Полярность и сила межмолекулярных взаимодействий | Относительно невысокая по сравнению с аффинным методом |
| Ключевое преимущество аффинного метода | Селективное молекулярное распознавание | Комплементарность структуры лиганда и аналита | Позволяет получать высокоочищенный целевой компонент из сложных смесей |
| Способ элюирования при аффинной хроматографии | Ослабление или конкурентное нарушение связи | Изменение pH, ионной силы либо добавление конкурента | Обеспечивает направленное высвобождение связанного аналита |
Высокая селективность аффинной хроматографии определяется не общей характеристикой молекул, а наличием конкретного участка специфического связывания. Это делает метод особенно ценным при работе со сложными биологическими образцами, содержащими множество сходных компонентов. Ограничениями являются необходимость подбора специфического лиганда, его иммобилизации и сохранения функциональной активности. Тем не менее по степени молекулярной избирательности аффинная хроматография превосходит методы, основанные только на различиях заряда, размера или адсорбционных свойств.