2) фиксация в гидрофобном слое
3) фиксация через взаимодействие с ионами тяжёлых металлов
4) связь денатурированного энзима с компонентами электрода
Иммобилизация энзима означает его закрепление в ограниченном объёме на поверхности или внутри матрицы электрода с сохранением каталитической активности. При сополимеризации с другими энзимами или белками формируется нерастворимая белково-полимерная сетка, в которой молекулы биокатализатора удерживаются за счёт химического сшивания и пространственного включения. В качестве сшивающих агентов могут использоваться бифункциональные реагенты, например глутаровый альдегид; конкретная технология зависит от состава чувствительного слоя.
Такой способ позволяет одновременно закрепить несколько ферментов и создать многокомпонентную биокаталитическую систему. Субстрат диффундирует в иммобилизованный слой, превращается под действием фермента, а образующийся продукт либо расходуемый со-субстрат изменяет электрический сигнал — ток, потенциал или проводимость. Интенсивность сигнала связана с активностью фермента и концентрацией определяемого вещества, поэтому сохранение нативной конфигурации активного центра является обязательным условием работоспособности ферментного электрода.
Другие указанные подходы не являются корректным обозначением данного вида иммобилизации либо сопровождаются существенными ограничениями. Адсорбция в гидрофобном слое возможна как вариант физического закрепления, но может вызывать денатурацию и десорбцию белка. Ионы тяжёлых металлов чаще ингибируют ферменты или вызывают их структурную инактивацию, а денатурированный энзим утрачивает каталитическую функцию и не обеспечивает селективное распознавание аналита.
| Способ закрепления | Механизм | Основное преимущество | Ключевое ограничение | Оценка для ферментного электрода |
|---|---|---|---|---|
| Сополимеризация с энзимами или белками | Формирование сшитой нерастворимой белково-полимерной сетки с включением активного фермента | Прочное удержание биокатализатора и возможность совместной фиксации нескольких ферментов | Снижение активности при чрезмерной плотности сшивания и ухудшении диффузии субстрата | Корректный вид иммобилизации; применяется для создания биоселективного слоя |
| Адсорбция | Неионные, ионные, гидрофобные или ван-дер-ваальсовы взаимодействия с поверхностью электрода | Простота и отсутствие необходимости химической модификации белка | Десорбция, зависимость от pH и ионной силы, возможная денатурация | Допустимый общий подход, но не тождественен указанной сополимеризации |
| Ковалентное связывание с носителем | Образование прочной химической связи между функциональными группами фермента и поверхности электрода | Высокая устойчивость к вымыванию и длительный срок работы электрода | Риск блокирования активного центра и необратимого снижения активности | Распространённый метод при контролируемой химии поверхности |
| Поперечное сшивание ферментных молекул | Соединение молекул фермента в нерастворимый агрегат химическими сшивками | Высокая локальная концентрация биокатализатора без отдельного носителя | Ограничения массопереноса и возможная потеря части каталитической активности | Близко по результату к белковой сополимеризации, но выделяется как самостоятельная технология |
| Иммобилизация в геле или полимерной мембране | Физическое удержание фермента в порах матрицы, отделённой от раствора проницаемым барьером | Защита от прямого контакта с электродом и сохранение микросреды фермента | Замедление диффузии аналита и продуктов реакции | Используется для формирования ферментного чувствительного слоя |
| Взаимодействие с ионами тяжёлых металлов | Координация металла с функциональными группами белка, преимущественно с тиоловыми и карбоксильными группами | Может применяться в специальных системах очистки или металл-аффинного связывания | Частое ингибирование, изменение конформации и денатурация фермента | Не является типичным универсальным способом иммобилизации активного энзима в электроде |
Сополимеризация обеспечивает сочетание механической фиксации и функциональной активности биоматериала. Эффективность электрода определяется не только количеством закреплённого фермента, но и доступностью его активного центра, проницаемостью матрицы и скоростью переноса электронов или электроактивного продукта. Оптимальная иммобилизация должна минимизировать вымывание фермента, не препятствовать диффузии субстрата и сохранять аналитическую селективность. Поэтому именно формирование совместной белково-полимерной структуры рассматривается как обоснованный вариант закрепления энзима.