2) светового
3) темнопольного
4) фазово-контрастного
Флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) оценивают с помощью люминесцентного, или флуоресцентного, микроскопа, чаще эпифлуоресцентного. Метод основан на гибридизации флуорохром-меченых ДНК- или РНК-зондов с комплементарными нуклеотидными последовательностями непосредственно в клетках или тканевых срезах. После возбуждения флуорохрома светом определённой длины волны он испускает свет с большей длиной волны, который регистрируется оптической системой микроскопа.
В конструкции флуоресцентного микроскопа используются источник возбуждающего излучения, набор фильтров и дихроичное зеркало, разделяющее возбуждающий и эмиссионный свет. Это позволяет визуализировать специфические сигналы зонда на фоне клеточной морфологии и ядерной контрастной окраски, например DAPI. Результат оценивают по числу, локализации, цвету и взаимному расположению сигналов: выявляют амплификацию, делецию, транслокацию, слияние или разрыв генетического локуса.
Обычный световой, темнопольный и фазово-контрастный микроскопы предназначены преимущественно для наблюдения окрашенных, рассеивающих или фазовых структур и не обеспечивают селективной регистрации флуоресценции FISH-зондов. Конфокальная микроскопия также может применяться для получения оптических срезов и трёхмерной реконструкции, однако в рутинной лабораторной диагностике основным инструментом остаётся флуоресцентный микроскоп.
| Метод микроскопии | Принцип формирования изображения | Информативность при FISH |
|---|---|---|
| Флуоресцентная | Возбуждение флуорохрома и регистрация испускаемого им света через селективные фильтры | Основной метод; позволяет выявлять и подсчитывать специфические сигналы ДНК- или РНК-зондов |
| Световая, или светлопольная | Прохождение белого света через объект с регистрацией поглощения и окраски | Не подходит для стандартной оценки флуоресцентных сигналов; может использоваться для морфологического контроля |
| Темнопольная | Изображение формируется преимущественно рассеянным светом при косом освещении | Применяется для отдельных рассеивающих частиц и микроорганизмов, но не для специфической регистрации FISH-сигналов |
| Фазово-контрастная | Преобразование различий фаз световой волны в различия яркости изображения | Позволяет изучать прозрачные живые клетки, но не различает флуорохромы зондов по спектральным характеристикам |
| Конфокальная флуоресцентная | Лазерное сканирование и отсечение внефокусного света через конфокальную диафрагму | Повышает пространственное разрешение и позволяет выполнять оптическое секционирование; чаще используется в специализированных исследованиях |
| Критерии достоверной оценки FISH | Анализ сигнала в нужном спектральном канале с учётом морфологии ядра и контрольных препаратов | Учитывают специфичность, число и локализацию сигналов, фон, сохранность ядер и соответствие внутренним контролям |
Таким образом, выбор флуоресцентного микроскопа определяется физическим принципом FISH — регистрацией света, испускаемого флуорохром-меченым зондом. Для корректной интерпретации важно использовать соответствующие фильтры для каждого флуорофора и исключать аутофлуоресценцию или неспецифическое свечение. Оценка проводится по валидированным критериям лаборатории и с обязательным учётом положительных и отрицательных контролей.