2) специфической реакции антиген-антитело
3) уменьшении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот
4) увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (+)
Принцип амплификации в молекулярной диагностике заключается в многократном увеличении числа копий определённого фрагмента нуклеиновой кислоты, соответствующего искомому возбудителю, гену или мутации. Наиболее распространённый вариант — полимеразная цепная реакция (ПЦР), при которой целевой участок ДНК последовательно денатурируется, к нему присоединяются специфические праймеры, а ДНК-полимераза синтезирует комплементарные цепи. При повторении циклов количество ампликона в идеальных условиях возрастает экспоненциально.
Специфичность реакции определяется последовательностью праймеров и, при необходимости, флуоресцентного зонда, комплементарных участку-мишени. Если исходным материалом служит РНК, перед амплификацией выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК; такой формат применяется, например, при выявлении РНК-содержащих вирусов. Люминесценция или флуоресценция в режиме реального времени является способом регистрации накопления продукта, а реакция антиген–антитело относится к иммунологическим методам и не является основой амплификации нуклеиновых кислот.
Увеличение количества копий мишени повышает аналитическую чувствительность исследования и позволяет обнаруживать небольшие концентрации генетического материала в клиническом образце. Результат может оцениваться качественно — по наличию или отсутствию ампликона, либо количественно — по значению порогового цикла и рассчитанной концентрации. Достоверность анализа требует положительного и отрицательного контролей, контроля выделения и исключения контаминации ампликонами.
| Метод | Исходная мишень | Механизм амплификации | Основной формат результата | Типичное применение |
|---|---|---|---|---|
| ПЦР | ДНК | Циклическая денатурация, отжиг праймеров и синтез новых цепей термостабильной полимеразой | Качественное обнаружение ампликона | Выявление ДНК возбудителей, генетических вариантов и мутаций |
| ПЦР в реальном времени (qPCR) | ДНК | Амплификация с одновременной регистрацией флуоресцентного сигнала | Качественный или количественный результат; пороговый цикл Ct/Cq | Определение вирусной нагрузки, экспрессии или количества копий гена |
| ОТ-ПЦР | РНК | Обратная транскрипция РНК в кДНК с последующей ПЦР | Обнаружение РНК-мишени | Диагностика инфекций, вызванных РНК-содержащими вирусами |
| ОТ-qPCR | РНК | Обратная транскрипция и количественная амплификация с флуоресцентным мониторингом | Количественная оценка РНК | Определение вирусной нагрузки и анализ транскриптов |
| LAMP | ДНК или кДНК | Изотермическая амплификация с использованием нескольких праймеров и полимеразы с вытеснением цепи | Быстрый качественный или полуколичественный результат | Экспресс-диагностика вне сложного лабораторного оборудования |
| TMA/NASBA | Преимущественно РНК | Изотермическая транскрипционно-опосредованная амплификация с участием обратной транскриптазы и РНК-полимеразы | Выявление и количественная оценка РНК | Диагностика инфекций и высокочувствительное выявление РНК-мишеней |
Таким образом, амплификационные методы не создают новый биологический объект, а копируют выбранную последовательность нуклеиновой кислоты in vitro. Праймеры обеспечивают адресность реакции, а ферментативный синтез — накопление целевого продукта. Повышение числа копий делает возможным обнаружение мишени даже при низком исходном содержании материала. Интерпретация результата должна учитывать качество образца, наличие ингибиторов, контрольные реакции и клинико-эпидемиологические данные.