2) антитела к возбудителю
3) ДНК возбудителя (+)
4) антигенные детерминанты возбудителя
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) предназначена для выявления специфического участка нуклеиновой кислоты микроорганизма. В ходе реакции выбранный фрагмент ДНК многократно амплифицируется с помощью праймеров, термостабильной ДНК-полимеразы и последовательных циклов денатурации, отжига и элонгации. Наличие амплифицированного продукта регистрируют, как правило, флуоресцентным методом в режиме реального времени или после завершения реакции.
Поэтому результат ПЦР отражает обнаружение ДНК возбудителя либо, для РНК-содержащих вирусов, предварительно синтезированной комплементарной ДНК в формате ОТ-ПЦР. Метод отличается высокой аналитической чувствительностью и специфичностью, поскольку праймеры подбирают к уникальным генетическим последовательностям микроорганизма. Обнаружение нуклеиновой кислоты не всегда свидетельствует о наличии жизнеспособного возбудителя: генетический материал может сохраняться после его инактивации, поэтому результат оценивают совместно с клиническими данными, сроками заболевания и другими лабораторными исследованиями.
Специфические белки и антигенные детерминанты выявляют иммунологическими методами, например иммуноферментным анализом или иммунохроматографией, а антитела пациента определяют в серологических тестах. Для достоверности ПЦР необходимы отрицательный контроль, положительный контроль и внутренний контроль взятия материала или ингибирования реакции. Количественная ПЦР дополнительно позволяет оценить концентрацию нуклеиновой кислоты по пороговому циклу и калибровочной кривой.
| Метод | Исследуемая мишень | Что означает положительный результат | Основные особенности |
|---|---|---|---|
| ПЦР | Специфический фрагмент ДНК | Обнаружение генетического материала возбудителя в образце | Высокая чувствительность и специфичность; не подтверждает жизнеспособность микроорганизма |
| ОТ-ПЦР | РНК возбудителя после обратной транскрипции в кДНК | Наличие РНК-содержащего инфекционного агента или его генетического материала | Применяется преимущественно для диагностики РНК-вирусных инфекций |
| ИФА на антиген | Белковые антигены или эпитопы возбудителя | Присутствие структурных компонентов микроорганизма | Обычно быстрее ПЦР, но чувствительность может быть ниже при малой концентрации антигена |
| Серологическое исследование | Специфические IgM, IgG и другие антитела пациента | Иммунный ответ на инфекцию или предшествующий контакт | Результат зависит от периода сероконверсии и иммунного статуса пациента |
| Культуральный метод | Жизнеспособный микроорганизм | Рост возбудителя на питательной среде | Позволяет идентифицировать изолят и определить чувствительность, но часто требует длительного времени |
| Микроскопия | Морфологические структуры клеток или микроорганизмов | Наличие видимых возбудителей либо характерных клеточных изменений | Быстрый метод, однако его информативность зависит от количества возбудителя и качества материала |
Интерпретация ПЦР требует соблюдения правил преаналитического этапа: правильного выбора биоматериала, сроков взятия и условий транспортировки. Ложноотрицательный результат возможен при недостаточном количестве материала, наличии ингибиторов или несоответствии праймеров генетическому варианту возбудителя. Ложноположительные результаты чаще связаны с контаминацией ампликонами или перекрёстным загрязнением образцов. Именно поэтому молекулярно-генетическое заключение должно учитывать клиническую картину, эпидемиологический анамнез и результаты контроля качества.