2) 9-10; калия гидроксида
3) 8-9; натрия гидрокарбоната (+)
4) 2-3; серной кислоты
Морфин и многие его производные относятся к слабым органическим основаниям за счёт третичной аминогруппы. В кислой моче они преимущественно находятся в протонированной, ионизированной форме, хорошо растворимой в водной фазе и плохо переходящей в органический растворитель. При повышении pH до 8–9 равновесие смещается в сторону свободного основания, поэтому возрастает доля липофильной неионизированной формы и коэффициент её распределения в системе моча — органический растворитель .
Гидрокарбонат натрия создаёт мягкую щелочную среду и позволяет поддерживать необходимый диапазон pH без резкого избытка гидроксид-ионов. Для морфина, имеющего значение pKa аминогруппы приблизительно 8,0–8,2, такой диапазон является оптимальным: значительная часть молекул становится неионизированной, но сохраняются приемлемые условия для жидкость-жидкостной экстракции и отделения мешающих компонентов мочи. Поэтому экстракция при pH 8–9 в среде гидрокарбоната натрия повышает выход морфиновых производных в органическую фазу.
Сильное подщелачивание раствором гидроксида калия также увеличивает долю свободного основания, однако оно не является оптимальным регламентированным условием для данной методики. Чрезмерно щелочная среда может усиливать переход в экстракт сопутствующих веществ, изменять состав матрицы и ухудшать воспроизводимость разделения. В кислой среде, напротив, образуются водорастворимые соли морфина, поэтому его извлечение органическим растворителем снижается.
| Условия среды | Преимущественная форма морфина | Переход в органическую фазу | Аналитическое значение |
|---|---|---|---|
| pH 2–3, серная кислота | Протонированная катионная форма | Минимальный | Морфин удерживается в водной фазе в виде растворимой соли |
| pH 6–7, фосфатный буфер | Смешанная ионизированная и неионизированная формы | Ограниченный | Недостаточная степень перевода слабого основания в свободную форму |
| pH 8–9, гидрокарбонат натрия | Возрастает доля неионизированной формы | Оптимальный для рутинной экстракции | Повышается выход морфиновых производных в органический растворитель |
| pH 9–10, гидроксид калия | Преимущественно свободное основание | Высокий, но менее селективный | Сильное подщелачивание может увеличить матричные помехи и снизить воспроизводимость |
| Нейтральная моча с высоким содержанием солей | Преимущественно ионизированная форма | Зависит от состава матрицы | Возможны колебания распределения и эмульгирование при экстракции |
| Гидролиз конъюгатов перед экстракцией | Высвобождается свободный морфин | Повышается после последующего подщелачивания | Необходим при определении общего морфина, включая морфин-3- и морфин-6-глюкурониды |
Выбор pH является принципом кислотно-основной экстракции: неионизированные молекулы лучше растворяются в органической фазе, а ионизированные — в водной. Гидрокарбонат натрия обеспечивает нужную степень подщелачивания и одновременно более мягкие условия обработки образца. После экстракции наличие морфина и его метаболитов подтверждают специфичными методами, такими как газовая или жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием. Отдельное измерение свободного морфина и общего морфина после гидролиза позволяет учитывать конъюгированные формы вещества.