2) внутренние контроли, ДНК-зонды (+)
3) ДНК-дуплексы
4) праймер-димеры
К дополнительным компонентам реакционной смеси при проведении ПЦР относятся внутренние контроли и ДНК-зонды. Внутренний контроль представляет собой контрольную нуклеиновую кислоту, которая может добавляться в исследуемый образец до экстракции или непосредственно в реакционную смесь. Его амплификация позволяет оценить полноценность выделения нуклеиновой кислоты, отсутствие ингибиторов и корректность работы ферментативной системы. Отрицательный результат по мишени при отсутствии сигнала внутреннего контроля не следует интерпретировать как достоверное отсутствие возбудителя: такой результат может быть связан с ингибированием реакции или технической ошибкой.
ДНК-зонды являются специфичными олигонуклеотидами, комплементарными участку амплифицируемой последовательности. В ПЦР в реальном времени они обычно несут флуорофор и гаситель; при гибридизации с ампликоном и его разрушении во время элонгации флуоресцентный сигнал возрастает пропорционально количеству исходной мишени. Пирофосфаты образуются как побочный продукт присоединения дезоксинуклеозидтрифосфатов, ДНК-дуплексы и праймер-димеры являются продуктами либо артефактами реакции, поэтому не относятся к дополнительным компонентам, вводимым в реакционную смесь.
| Компонент или образование | Роль в ПЦР | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Матрица ДНК или кДНК | Содержит амплифицируемую последовательность; при РНК-мишени предварительно выполняется обратная транскрипция | Определяет наличие исследуемого генетического материала |
| Праймеры | Фланкируют целевой участок и задают границы ампликона | Обеспечивают специфичность и эффективность амплификации |
| dNTP, термостабильная ДНК-полимераза, Mg2+ и буфер | Обеспечивают синтез новых цепей ДНК и оптимальные условия ферментативной реакции | Относятся к базовым, а не к дополнительным компонентам |
| Внутренний контроль | Контролирует экстракцию, наличие ингибиторов и прохождение амплификации | Позволяет отличить истинно отрицательный результат от недействительного |
| Флуоресцентный ДНК-зонд | Специфически связывается с ампликоном и формирует регистрируемый сигнал | Используется для детекции и количественной оценки мишени в ПЦР в реальном времени |
| Пирофосфаты | Высвобождаются при включении нуклеотидов в растущую цепь ДНК | Являются продуктом реакции, а не стандартным добавляемым компонентом |
| Праймер-димеры | Возникают при неспецифическом взаимодействии праймеров и их удлинении | Могут вызывать ложный сигнал и снижение аналитической специфичности |
Внутренний контроль особенно важен при исследовании клинического материала, содержащего ингибиторы полимеразной реакции, например гемоглобин, соли желчных кислот или компоненты транспортных сред. ДНК-зонд повышает специфичность обнаружения по сравнению с регистрацией только неспецифического флуоресцентного сигнала интеркалирующего красителя. Интерпретация результата должна учитывать одновременно сигнал целевой мишени, внутреннего контроля и параметры положительного и отрицательного контролей. Такое сочетание обеспечивает аналитическую валидность и снижает риск ложноотрицательных и ложноположительных заключений.