2) ревертаза
3) лигаза
4) трипсин
Для постановки полимеразной цепной реакции необходима ДНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент, катализирующий синтез новой цепи ДНК в направлении 5′→3′. В диагностической практике используют термостабильные полимеразы, преимущественно Taq-полимеразу, сохраняющую активность после многократных циклов денатурации при высокой температуре. Благодаря этому происходит экспоненциальная амплификация целевого фрагмента нуклеиновой кислоты.
Цикл ПЦР включает денатурацию матричной ДНК, отжиг праймеров и элонгацию — достраивание комплементарной цепи полимеразой. Для реакции также необходимы матрица, праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, ионы магния и буферная система, однако именно полимераза обеспечивает образование новых копий амплифицируемого фрагмента. Поэтому правильным является вариант полимераза .
Ревертаза используется не в классической ПЦР, а на этапе обратной транскрипции при исследовании РНК методом ОТ-ПЦР, когда сначала синтезируется комплементарная ДНК. Лигаза соединяет фрагменты ДНК и применяется в других молекулярно-биологических методах, а трипсин является протеолитическим ферментом и не участвует в амплификации нуклеиновых кислот.
| Фермент или компонент | Основная функция | Роль в ПЦР |
|---|---|---|
| Термостабильная ДНК-полимераза | Синтез новой цепи ДНК по матрице | Ключевой фермент каждого цикла амплификации |
| Ревертаза | Синтез ДНК на матрице РНК | Необходима при ОТ-ПЦР для анализа РНК, но не для стандартной ПЦР |
| ДНК-лигаза | Соединение фрагментов ДНК фосфодиэфирной связью | Не катализирует амплификацию в ПЦР |
| Трипсин | Гидролиз пептидных связей в белках | Протеаза, не участвующая в синтезе ДНК |
| Праймеры | Определяют границы амплифицируемого участка и предоставляют 3′-ОН-группу | Обеспечивают специфичность и запуск синтеза полимеразой |
| Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и Mg2+ | Служат субстратами и кофактором полимеразной реакции | Необходимы для элонгации цепи ДНК |
В классической ПЦР исходной матрицей служит ДНК, поэтому ключевым ферментом является термостабильная ДНК-полимераза. При выявлении РНК-содержащих возбудителей применяют формат ОТ-ПЦР, сочетающий обратную транскрипцию и последующую амплификацию. Выбор фермента определяется типом исследуемой нуклеиновой кислоты и аналитической задачей метода.