2) специфических химических реакций для определения в клетках различных веществ
3) праймеров (затравок), комплементарных к определенным геномным участкам
4) флуоресцентно-меченных зондов, комплементарных к определенным геномным участкам (+)
Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) основан на связывании флуоресцентно меченных нуклеотидных зондов с комплементарными последовательностями ДНК в фиксированных клетках или хромосомах. Перед гибридизацией двухцепочечную ДНК денатурируют, после чего зонд присоединяется к строго определённому геномному участку по принципу комплементарности оснований. Флуоресцентные сигналы визуализируют с помощью люминесцентной микроскопии и оценивают их количество и расположение.
В зависимости от конструкции зонда FISH позволяет выявлять числовые и структурные хромосомные аномалии: анеуплоидии, микроделеции, амплификацию генов и транслокации. Исследование можно выполнять на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах, поэтому для него не всегда требуется культивирование клеток. Количество сигналов отражает число копий мишени, а их пространственное разделение или слияние указывает на наличие определённых перестроек.
Праймеры, комплементарные участкам генома, применяют преимущественно в полимеразной цепной реакции, где они обеспечивают амплификацию ДНК. Меченные антитела являются основой иммуногистохимии и выявляют белковые антигены, а специфические химические реакции используются в цитохимических методах для определения веществ в клетке. Отличительная особенность FISH — непосредственная визуализация выбранной последовательности ДНК в её клеточном или хромосомном окружении.
| Тип зонда или метода | Мишень | Диагностический признак | Примеры применения |
|---|---|---|---|
| Локус-специфический зонд | Определённый ген или участок хромосомы | Изменение числа сигналов указывает на делецию или амплификацию | Оценка HER2, микроделеции 22q11.2, потери локуса |
| Центромерный зонд | Альфа-сателлитные последовательности центромер | Подсчёт сигналов отражает число копий соответствующей хромосомы | Выявление трисомий, моносомий, полиплоидии |
| Break-apart-зонд | Два участка по разные стороны гена-мишени | Разделение сигналов свидетельствует о перестройке данного гена независимо от партнёра | Исследование перестроек ALK, ROS1, RET и других генов |
| Dual-fusion-зонд | Два гена, участвующие в известной транслокации | Появление слитого сигнала указывает на физическое сближение или слияние локусов | Выявление BCR::ABL1 и других специфических транслокаций |
| Зонд цельнохромосомной раскраски | Многочисленные последовательности одной хромосомы | Изменение окраски участков выявляет крупные структурные перестройки | Анализ сложных транслокаций и маркерных хромосом |
| Полимеразная цепная реакция | ДНК-участок, ограниченный праймерами | Амплификация и количественное или качественное выявление фрагмента без его пространственной локализации | Молекулярная диагностика инфекций и генетических вариантов |
Интерпретация FISH требует учёта фонового свечения, перекрывания сигналов, особенностей срезов и минимального числа анализируемых ядер. Результат оценивают относительно нормативных порогов лаборатории и внутреннего контроля качества. Метод особенно полезен при быстром подтверждении заранее предполагаемой хромосомной или генной аномалии. Ограничение FISH состоит в том, что он выявляет преимущественно те изменения, для поиска которых заранее подобраны соответствующие зонды.