2) качественного определения специфичного фрагмента ДНК/РНК
3) количественного определения специфичного фрагмента ДНК/РНК (+)
4) количественного определения специфичного антитела
ПЦР в реальном времени предназначена прежде всего для количественного определения специфического фрагмента нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. В ходе реакции амплификация контролируется после каждого цикла по интенсивности флуоресцентного сигнала, возникающего при использовании интеркалирующего красителя или специфического флуоресцентного зонда. По циклу пересечения пороговой линии (Ct/Cq) рассчитывают исходное количество мишени: чем выше её концентрация в образце, тем раньше регистрируется сигнал.
Количественный результат получают с использованием калибровочной кривой, построенной по стандартам с известным содержанием нуклеиновой кислоты, либо относительно внутреннего контрольного гена. При исследовании РНК предварительно выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК; такой вариант обозначают как ОТ-ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). Метод применяют, например, для определения вирусной нагрузки, концентрации бактериального или грибкового возбудителя, а также экспрессии генов.
Специфичность анализа обеспечивается подбором праймеров и, при необходимости, гидролизного зонда к уникальному участку генома. Антитела методом ПЦР непосредственно не определяются: для их выявления используют иммунохимические методы, включая ИФА, хемилюминесцентный анализ и иммуноблоттинг. Поэтому ключевым признаком ПЦР в реальном времени является количественная оценка нуклеиновой кислоты по динамике флуоресценции.
| Метод | Исследуемый материал или мишень | Принцип регистрации | Основной результат | Типичное применение |
|---|---|---|---|---|
| ПЦР с детекцией в конечной точке | Специфический фрагмент ДНК | Анализ продукта после завершения амплификации | Преимущественно качественный | Подтверждение наличия генетической мишени |
| ПЦР в реальном времени (qPCR) | Специфический фрагмент ДНК | Регистрация флуоресценции в каждом цикле | Количественный, с оценкой Ct/Cq | Определение копий гена, бактериальной или вирусной нагрузки |
| ОТ-ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) | РНК с предварительным синтезом кДНК | Обратная транскрипция и последующая амплификация | Количественный уровень РНК | Диагностика РНК-содержащих вирусов, исследование экспрессии генов |
| Цифровая ПЦР | ДНК или кДНК | Разделение образца на множество микрореакций | Абсолютное число копий без стандартной кривой | Низкокопийные мишени, редкие мутации, контроль минимальной остаточной болезни |
| ИФА | Антиген или специфическое антитело | Иммунная реакция с ферментной меткой | Концентрация или титр иммунореагента | Серодиагностика, определение антител классов IgM и IgG |
| Иммунохемилюминесцентный анализ | Антиген, антитело или гормон | Регистрация хемилюминесцентного сигнала | Количественное или качественное иммунологическое определение | Высокочувствительная лабораторная диагностика белковых маркеров |
Интерпретация Ct/Cq возможна только при соблюдении требований к качеству образца, эффективности амплификации и работе внутренних контролей. Низкое значение Ct не является самостоятельным критерием тяжести заболевания и должно оцениваться вместе с клиническими данными и порогами конкретной тест-системы. Для сопоставимости результатов используют одинаковые калибраторы, единицы измерения и стандартизированные условия исследования.