2) амплификация ДНК-фрагментов
3) гибридизация ДНК-продуктов амплификации
4) детекция ДНК-продуктов амплификации
Начальным этапом лабораторного ПЦР-анализа является выделение нуклеиновой кислоты из исследуемого биологического материала. Для ПЦР, направленной на выявление ДНК-мишени, необходимо получить очищенную ДНК, пригодную для последующей амплификации. На этапе пробоподготовки клетки или микроорганизмы лизируют, освобождая нуклеиновые кислоты, после чего ДНК отделяют от белков, липидов, солей и других компонентов образца.
Качество выделения ДНК существенно влияет на чувствительность и воспроизводимость исследования. Недостаточная очистка может привести к сохранению ингибиторов ДНК-полимеразы, например гемоглобина, гепарина или компонентов биологических жидкостей, и вызвать ложноотрицательный результат. Только после получения пригодного образца нуклеиновой кислоты проводят собственно амплификацию выбранного участка ДНК с использованием праймеров и термостабильной ДНК-полимеразы.
Гибридизация и детекция относятся к более поздним этапам исследования. В классической ПЦР продукты амплификации могут выявляться после завершения реакции, например методом электрофореза, тогда как в ПЦР в реальном времени накопление ампликона регистрируется непосредственно во время циклов реакции по флуоресцентному сигналу. Независимо от способа детекции аналитическому этапу предшествует корректная подготовка и выделение нуклеиновой кислоты.
| Этап ПЦР-анализа | Основное содержание | Диагностическое значение |
|---|---|---|
| Пробоподготовка | Подготовка клинического материала, его гомогенизация или предварительная обработка | Обеспечивает пригодность образца для выделения нуклеиновых кислот |
| Выделение ДНК | Лизис материала, очистка и концентрирование ДНК | Формирует исходную матрицу для ПЦР и удаляет ингибиторы реакции |
| Приготовление реакционной смеси | Добавление праймеров, нуклеотидов, буфера и термостабильной ДНК-полимеразы | Создает условия для специфического копирования целевого участка |
| Амплификация | Последовательные циклы денатурации, отжига праймеров и элонгации | Обеспечивает многократное увеличение количества целевой последовательности |
| Гибридизация | Связывание специфического зонда с комплементарной последовательностью ампликона | Повышает специфичность идентификации исследуемой мишени |
| Детекция | Регистрация продуктов ПЦР флуоресцентным, электрофоретическим или иным методом | Позволяет установить наличие и, при количественной ПЦР, количество мишени |
| Интерпретация результата | Оценка сигнала с учетом положительного, отрицательного и внутреннего контролей | Позволяет исключить контаминацию, ингибирование и технические ошибки |
Преаналитический этап ПЦР имеет такое же принципиальное значение, как и сама реакция амплификации. Нарушение условий забора, транспортировки или выделения ДНК способно снизить диагностическую чувствительность метода даже при исправной работе амплификатора. Для контроля качества применяют внутренние контрольные образцы, позволяющие выявлять ингибирование реакции и ошибки пробоподготовки. Строгое пространственное разделение этапов работы также необходимо для предупреждения контаминации ампликонами и ложноположительных результатов.