2) дегидратации
3) денатурации (+)
4) хроматографии на природных носителях
Денатурация — это нарушение нативной пространственной организации белка с изменением вторичной, третичной и, при наличии, четвертичной структуры. При этом пептидные связи и первичная структура обычно сохраняются, однако разрушаются водородные, ионные, гидрофобные и другие нековалентные взаимодействия, поддерживающие конформацию молекулы. В результате изменяется конфигурация активного центра фермента или участка связывания, поэтому белок утрачивает каталитическую, рецепторную, транспортную либо иммунологическую активность.
Денатурацию вызывают нагревание, экстремальные значения pH, органические растворители, детергенты, соли тяжёлых металлов, высокие концентрации мочевины и другие физико-химические воздействия. Она может быть обратимой, если нативная конформация восстанавливается после устранения повреждающего фактора, но часто становится необратимой из-за агрегации и выпадения белка в осадок. В отличие от денатурации, гидролитическое разрушение пептидных связей представляет собой деградацию первичной структуры и приводит к распаду белка на пептиды и аминокислоты.
Электрофорез и хроматография являются методами разделения и анализа; при использовании мягких, нативных условий они не обязательно изменяют биологические свойства белка. Дегидратация может нарушать гидратационную оболочку и способствовать потере активности, однако сама по себе не является универсальным определяющим механизмом. Поэтому именно денатурация считается непосредственной причиной утраты функциональной активности белка вследствие изменения его пространственной структуры.
| Процесс или воздействие | Основное изменение белка | Состояние биологической активности | Пример или диагностическое значение |
|---|---|---|---|
| Денатурация | Нарушение вторичной, третичной и четвертичной структуры при относительном сохранении первичной | Снижается или полностью утрачивается вследствие деформации активного центра | Инактивация фермента при нагревании или воздействии экстремального pH |
| Гидролитическая деградация | Разрыв пептидных связей и разрушение первичной структуры | Утрата активности необратима | Протеолиз, приводящий к образованию пептидов и аминокислот |
| Электрофорез в нативных условиях | Разделение молекул по заряду, размеру и форме без обязательного нарушения конформации | Может сохраняться | Нативный электрофорез для анализа функционально активных белковых комплексов |
| SDS-электрофорез | Детергент связывается с белком, вызывает его разворачивание и придаёт отрицательный заряд | Обычно утрачивается | Используется для определения молекулярной массы, а не для оценки активности |
| Хроматография на природных носителях | Адсорбция или специфическое взаимодействие с неподвижной фазой | При щадящем буфере обычно сохраняется | Аффинная очистка белков с последующим функциональным анализом |
| Дегидратация | Удаление связанной воды и нарушение гидратационной оболочки | Может временно снижаться или утрачиваться; иногда восстанавливается после регидратации | Имеет значение при лиофилизации и хранении белковых препаратов |
В клинической лабораторной диагностике сохранность нативной конформации особенно важна при определении активности ферментов, гормонов, антител и факторов свертывания. Поэтому регламентируются температура, pH, ионная сила буфера, сроки хранения и число циклов замораживания и размораживания образца. Изменение этих условий может привести к получению ложно сниженных результатов функциональных тестов даже при сохранении общей концентрации белка. Количественное выявление белка не всегда свидетельствует о сохранении его биологической активности.