2) ферментативный гидролиз извлечения (или биожидкости, биоткани) с последующей жидкостью – жидкостной экстракцией при рН = 2
3) прямую экстракцию метанолом
4) щелочной гидролиз извлечения (или биожидкости, биоткани) с последующей жидкостью – жидкостной экстракцией при рН = 5
Производные 1,4-бензодиазепина в биологических жидкостях, особенно в моче, нередко присутствуют не только в свободном виде, но и как конъюгаты с глюкуроновой кислотой. Кислотный гидролиз разрушает такие конъюгаты и переводит связанное вещество в свободную форму, благодаря чему выявляется суммарное содержание бензодиазепина и его метаболитов, а не только небольшая свободная фракция.
После гидролиза среду подщелачивают до рН 9. Большинство бензодиазепинов относится к слабым основаниям; в щелочной среде они преимущественно находятся в неионизированной, более липофильной форме и эффективно переходят в органический слой при жидкость–жидкостной экстракции. При рН 2 соединения протонируются, образуют водорастворимые катионные формы и остаются преимущественно в водной фазе, тогда как прямая экстракция метанолом не обеспечивает деконъюгации и достаточного отделения аналита от компонентов матрицы.
| Этап или условие | Химический эффект | Значение для анализа |
|---|---|---|
| Кислотный гидролиз | Расщепление конъюгатов, прежде всего глюкуронидов | Высвобождение связанного бензодиазепина и повышение полноты выявления |
| Подщелачивание до рН 9 | Переход слабого основания в преимущественно неионизированную форму | Создание условий для перехода вещества в органический экстракт |
| Жидкость–жидкостная экстракция при рН 9 | Распределение липофильного нейтрального соединения между фазами | Концентрирование аналита и удаление значительной части водорастворимых примесей |
| Экстракция при рН 2 | Протонирование бензодиазепина с образованием катионной формы | Удержание соединения в водной фазе и низкая эффективность органической экстракции |
| Ферментативный гидролиз | Расщепление конъюгатов зависит от вида фермента, времени и условий инкубации | Возможны неполная конверсия и вариабельность результата; метод требует отдельной валидации |
| Прямая экстракция метанолом | Извлечение части свободных соединений без обязательного разрушения конъюгатов | Риск занижения результата и повышенного матричного влияния |
| Щелочной гидролиз с последующей экстракцией при рН 5 | Режим не соответствует оптимальному разделению слабого основания; при жёстком воздействии возможны побочные превращения | Недостаточная селективность и непредсказуемая полнота извлечения |
Таким образом, сочетание кислотного гидролиза и экстракции при рН 9 обеспечивает освобождение конъюгированных форм и перевод бензодиазепинов в удобную для извлечения нейтральную форму. Полученный экстракт может быть исследован методами тонкослойной хроматографии, газовой или жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Конкретные параметры гидролиза должны быть валидированы для каждого аналита, поскольку отдельные бензодиазепины и их метаболиты различаются по стабильности.