2) уменьшении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот
3) увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых кислот (+)
4) люминесценции возбужденных атомов и молекул образца
Амплификация в молекулярно-биологических методах означает многократное увеличение количества копий определённого фрагмента нуклеиновой кислоты in vitro. Наиболее распространённый вариант — полимеразная цепная реакция (ПЦР), при которой праймеры специфично ограничивают целевой участок ДНК, а термостабильная ДНК-полимераза синтезирует новые комплементарные цепи. Повторение циклов денатурации, отжига праймеров и элонгации приводит к экспоненциальному накоплению ампликона.
Именно увеличение числа копий целевого фрагмента позволяет обнаруживать исходно малое количество генетического материала микроорганизма, опухолевых клеток или наследственного варианта. Специфичность анализа определяется последовательностью праймеров и, при необходимости, флуоресцентного зонда, комплементарных диагностически значимому участку генома. Поэтому реакция антиген–антитело относится к иммунологическим методам, а люминесценция или флуоресценция — к способам регистрации сигнала, но не к сущности амплификации.
При исследовании РНК сначала выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК, после чего проводят её амплификацию. В количественной ПЦР накопление продукта регистрируют в реальном времени по флуоресцентному сигналу; значение порогового цикла обратно связано с исходным количеством мишени. Корректная интерпретация требует отрицательного контроля, положительного контроля и контроля выделения, поскольку высокая чувствительность метода создаёт риск ложноположительных результатов вследствие контаминации ампликонами.
| Метод | Исходный материал и мишень | Механизм | Основной результат |
|---|---|---|---|
| Классическая ПЦР | ДНК | Циклическое копирование заданного участка праймерами и ДНК-полимеразой | Наличие или отсутствие ампликона после завершения реакции |
| ОТ-ПЦР | РНК вирусов, клеток или тканей | Обратная транскрипция РНК в кДНК с последующей ПЦР | Обнаружение РНК-мишени в образце |
| Количественная ПЦР в реальном времени | ДНК или кДНК | Амплификация одновременно с регистрацией флуоресценции | Пороговый цикл и относительная или абсолютная концентрация мишени |
| Мультиплексная ПЦР | ДНК или кДНК | Параллельная амплификация нескольких мишеней в одной пробирке | Одновременное выявление нескольких возбудителей или генетических вариантов |
| LAMP-амплификация | ДНК или кДНК | Изотермическое многократное копирование с использованием нескольких праймеров | Быстрое качественное выявление нуклеиновой кислоты без термоциклера |
| Цифровая ПЦР | ДНК или кДНК | Разделение образца на множество микрореакций с последующей конечной регистрацией | Абсолютное количественное определение мишени и выявление низкочастотных вариантов |
Амплификация повышает аналитическую чувствительность, но не устраняет требований к качеству забора, транспортировки и выделения материала. Положительный результат должен оцениваться с учётом клинических данных, валидированной пороговой зоны и вероятности контаминации. Выявление нуклеиновой кислоты не всегда свидетельствует о наличии жизнеспособного микроорганизма, поскольку фрагменты генома могут сохраняться после его элиминации. Для подтверждения диагностической значимости применяют внутренние контроли, повторное исследование и сопоставление с другими лабораторными и клиническими признаками.