2) РНК
3) ампликоны (+)
4) праймеры
Продуктами полимеразной цепной реакции являются ампликоны — многочисленные копии заданного участка нуклеиновой кислоты, ограниченного последовательностями, комплементарными используемым праймерам. Их образование происходит в повторяющихся циклах денатурации матричной ДНК, отжига праймеров и элонгации новых цепей термостабильной ДНК-полимеразой. При достаточной эффективности реакции количество целевого фрагмента увеличивается экспоненциально.
Праймеры представляют собой короткие синтетические олигонуклеотиды и служат исходными реагентами, определяющими границы амплифицируемого участка, но сами не являются конечным продуктом анализа. РНК может выступать исходной матрицей при ПЦР с обратной транскрипцией: сначала она преобразуется в комплементарную ДНК, после чего амплифицируется уже ДНК-мишень. Белковые молекулы в механизме ПЦР не синтезируются, поскольку метод основан на матричном копировании нуклеиновых кислот.
| Компонент или результат | Роль в ПЦР | Дифференциальный признак |
|---|---|---|
| Ампликон | Конечный продукт амплификации целевого участка | Имеет заданную длину и последовательность, определяемые праймерами |
| Матричная ДНК | Содержит исследуемую последовательность | Является исходным материалом, а не продуктом реакции |
| Праймеры | Инициируют синтез новых цепей ДНК | Расходуются как реагенты и ограничивают амплифицируемый фрагмент |
| ДНК-полимераза | Катализирует присоединение нуклеотидов | Ферментативный компонент, не включаемый в структуру ампликона |
| Дезоксинуклеозидтрифосфаты | Служат субстратами для синтеза ДНК | Встраиваются в вновь образующиеся цепи |
| РНК при ОТ-ПЦР | Исходная мишень для обратной транскрипции | Сначала преобразуется в кДНК, которая затем амплифицируется |
| Флуоресцентный сигнал в ПЦР-РВ | Отражает накопление ампликонов | Является способом регистрации, а не самостоятельным продуктом ПЦР |
В клинической лабораторной диагностике наличие ампликона свидетельствует об обнаружении специфической нуклеотидной последовательности исследуемого возбудителя, гена или мутации. Специфичность результата зависит от правильного подбора праймеров и зонда, а достоверность — от применения положительного, отрицательного и внутреннего контролей. При ПЦР в реальном времени накопление ампликонов оценивают по пороговому циклу, значение которого обратно связано с исходным количеством мишени. Для исключения ложноположительных результатов необходимо строго предотвращать контаминацию лаборатории ранее синтезированными ампликонами.