2) только качественного
3) только количественного
4) достоверного
ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR, qPCR) предусматривает регистрацию накопления ампликона непосредственно в процессе циклов реакции. Образование специфического продукта сопровождается увеличением флуоресцентного сигнала, который измеряется после каждого цикла с использованием интеркалирующих красителей или флуоресцентно-меченых зондов. Поэтому метод позволяет установить наличие или отсутствие целевой нуклеиновой кислоты и одновременно оценить ее исходное количество.
Качественный результат формулируется как выявление либо невыявление мишени с учетом порога детекции и результатов контролей. Количественная оценка основана на значении Cq (Ct) — номера цикла, на котором флуоресценция превышает установленный порог: чем меньше Cq, тем выше исходная концентрация матрицы. Для абсолютного количественного анализа используют калибровочную кривую, построенную по стандартам с известной концентрацией; относительная количественная оценка требует нормализации по референсному гену или внутреннему контролю.
Таким образом, принцип регистрации сигнала в экспоненциальной фазе амплификации обеспечивает сочетание качественной и количественной диагностики. В отличие от классической ПЦР с анализом продукта только после завершения реакции, real-time PCR дает возможность отслеживать кинетику амплификации, контролировать специфичность реакции и выявлять ингибирование или недостаточную эффективность постановки.
| Критерий | Качественное применение | Количественное применение |
|---|---|---|
| Основная задача | Определить наличие или отсутствие целевой последовательности | Определить концентрацию или относительное количество мишени |
| Регистрируемый показатель | Факт пересечения флуоресцентным сигналом порогового уровня | Значение Cq/Ct и его соотношение с концентрацией матрицы |
| Способ интерпретации | Обнаружено или не обнаружено при корректных контролях | Расчет по калибровочной кривой либо методом относительной количественной оценки |
| Зависимость Cq от содержания мишени | Используется преимущественно для подтверждения наличия амплификации | Обратная: меньшее Cq соответствует большему исходному количеству нуклеиновой кислоты |
| Дополнительные требования | Специфичные праймеры или зонды, отрицательный и положительный контроли | Стандарты известной концентрации, оценка эффективности реакции и контроль линейности |
| Типичный результат | Выявление возбудителя, мутации или экспрессии целевого гена | Копии/мл, международные единицы/мл, относительная экспрессия или вирусная нагрузка |
Для надежной интерпретации учитывают внутренний контроль выделения и амплификации, поскольку отрицательный результат может быть связан с ингибированием реакции или недостаточным количеством материала. При исследовании РНК перед амплификацией выполняют обратную транскрипцию с образованием комплементарной ДНК. Количественные данные клинически значимы только в пределах валидированного линейного диапазона и при соблюдении требований к качеству образца.