2) прием, регистрацию и первичную обработку материала
3) учет результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза
4) учет результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом секвенирования
Вторая рабочая зона ПЦР-лаборатории предназначена для выделения нуклеиновых кислот из подготовленного биологического материала. На этом этапе разрушаются клеточные и вирусные структуры, нуклеиновые кислоты отделяются от белков, липидов, клеточного детрита и ингибиторов, после чего очищенный препарат элюируется и используется как матрица для амплификации. Методика может основываться на сорбции на силикагеле, магнитных частицах, мембранах или применении автоматизированных станций.
Такое зонирование является частью противоэпидемического и противоконтаминационного режима. Прием, регистрацию и первичную обработку образцов выполняют в первой зоне, до этапа экстракции. Амплификация и учет ее результатов относятся к последующим этапам: электрофорез проводят для разделения ампликонов по размеру, а секвенирование — для определения последовательности нуклеотидов; оба метода требуют уже полученного амплификационного продукта и не относятся к выделению нуклеиновых кислот.
| Рабочая зона или этап | Основные операции | Получаемый материал или результат | Ключевой риск |
|---|---|---|---|
| Первая зона | Прием, маркировка, регистрация, проверка соответствия и первичная обработка образцов | Подготовленный клинический материал | Ошибки идентификации и перекрестное загрязнение исходных образцов |
| Вторая зона | Лизис, экстракция, очистка и элюция ДНК или РНК | Очищенная нуклеиновая кислота — матрица для амплификации | Ингибирование реакции, потеря материала или контаминация экстрактов |
| Подготовка амплификационной смеси | Внесение матрицы в реакционную смесь с праймерами, нуклеотидами, буфером и ферментом | Готовая пробирка или планшет для ПЦР | Ложно-положительные результаты при заносе ампликонов |
| Амплификационная зона | Циклическая денатурация, отжиг праймеров и элонгация цепи | Многократно увеличенный фрагмент целевой последовательности | Неспецифическая амплификация и недостаточная эффективность реакции |
| Электрофоретическая детекция | Разделение ампликонов в электрическом поле и визуализация полос по размеру | Качественная оценка наличия продукта заданной длины | Ошибочная интерпретация неспецифических полос или праймер-димеров |
| Секвенирование | Определение последовательности нуклеотидов амплифицированного фрагмента | Нуклеотидная последовательность для видовой, генотипической или мутационной идентификации | Ошибки чтения, низкое качество сигнала и контаминация библиотек |
Разделение потоков от исходного материала к амплифицированному продукту организуют по принципу однонаправленного движения, не допуская возврата использованных материалов в предшествующие зоны. Для каждой серии исследований применяют отрицательные контроли, позволяющие выявить контаминацию, и положительные контроли, подтверждающие работоспособность реагентов и оборудования. Качество экстракции оценивают также по внутреннему контролю, который выявляет наличие ингибиторов и недостаточное извлечение нуклеиновой кислоты. Поэтому выделение нуклеиновых кислот является определяющей операцией именно второй рабочей зоны.