2) оптическая плотность светового потока определенной длины волны прямо пропорциональна концентрации растворенного вещества (+)
3) активность ферментов зависит от рН среды
4) осмолярность во всех жидких секторах организма должна быть одинаковой
Закон Бугера—Ламберта—Бера описывает поглощение монохроматического излучения раствором. При постоянных длине оптического пути и длине волны оптическая плотность (абсорбция) прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества: A = ε·l·c, где A — оптическая плотность, ε — молярный коэффициент поглощения, l — длина оптического пути, c — концентрация вещества. Поэтому увеличение содержания аналита приводит к линейному усилению поглощения света.
В клинической лабораторной диагностике этот принцип лежит в основе фотометрических и спектрофотометрических методов определения глюкозы, билирубина, гемоглобина, активности ферментов и других показателей. Прибор измеряет интенсивность падающего и прошедшего через образец света, после чего рассчитывает оптическую плотность: чем больше света поглощено раствором, тем выше значение A. Количественное содержание вещества определяют по калибровочному графику или сравнению с калибратором известной концентрации.
Линейная зависимость сохраняется преимущественно для разбавленных прозрачных растворов при использовании излучения соответствующей длины волны и отсутствии значимого светорассеяния, побочных реакций и влияния матрицы образца. При слишком высокой концентрации, мутности, гемолизе, липемии или билирубинемии возможны отклонения от закона, поэтому образец может потребовать разведения, холостой пробы или применения другой аналитической методики.
| Параметр | Содержание | Значение для лабораторного анализа |
|---|---|---|
| Оптическая плотность, A | Мера поглощения света раствором; связана с пропусканием формулой A = −lgT | Основной измеряемый сигнал в спектрофотометрии |
| Концентрация, c | Количество поглощающего вещества в единице объёма | Расчётный аналитический результат исследования |
| Длина оптического пути, l | Толщина слоя раствора, через который проходит свет | При увеличении длины кюветы оптическая плотность возрастает пропорционально |
| Молярный коэффициент поглощения, ε | Характеристика способности вещества поглощать свет при определённой длине волны | Определяет чувствительность метода и выбор аналитической длины волны |
| Калибровочный график | Зависимость сигнала прибора от концентрации стандартных растворов | Позволяет пересчитать оптическую плотность образца в концентрацию аналита |
| Причины отклонения от линейности | Высокая концентрация, мутность, светорассеяние, химические взаимодействия, постороннее поглощение | Могут приводить к систематической ошибке и требуют разведения либо коррекции измерения |
Таким образом, отмеченное положение отражает количественную основу абсорбционной фотометрии. Закон применим при контроле условий измерения и стабильности исследуемой системы. В ферментативных методах фотометрически часто регистрируют не только конечную оптическую плотность, но и скорость её изменения во времени. Достоверность результата обеспечивается правильным выбором длины волны, холостой пробы, калибраторов и диапазона линейности методики.