2) электрофоретическое разделение фрагментов НК после обработки эндонуклеазами рестрикции
3) гибридизация меченых РНК зондов с фрагментами ДНК на мембранах
4) гибридизация меченых ДНК зондов с фрагментами исследуемой ДНК на мембранах после электрофореза (+)
Блот-гибридизация по Саузерну предназначена для выявления определённой последовательности ДНК среди множества фрагментов генома. Исследуемую ДНК предварительно расщепляют рестриктазами, разделяют фрагменты электрофорезом в агарозном геле, денатурируют и переносят на нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. После этого мембрану инкубируют с меченым ДНК-зондом, комплементарным искомому участку; образовавшийся дуплекс выявляют по радиоактивной, флуоресцентной или хемилюминесцентной метке.
Поэтому верным является вариант, описывающий гибридизацию меченого ДНК-зонда с фрагментами исследуемой ДНК после электрофоретического разделения. Метод позволяет определить наличие специфической последовательности, размер соответствующего рестрикционного фрагмента и иногда число копий или структурные изменения гена. Он применялся для анализа рестрикционного полиморфизма, крупных делеций и дупликаций, перестроек генов, некоторых повторных экспансий и метилирования ДНК.
Электрофорез и расщепление рестриктазами являются подготовительными этапами, но сами по себе не обеспечивают специфического выявления нужного фрагмента. Выявление белков на мембране относится к иммуноблоттингу по Вестерну, а исследование РНК — к блот-гибридизации по Нозерну. Использование РНК-зондов технически возможно в отдельных вариантах гибридизации нуклеиновых кислот, однако классическое определение метода Саузерна связано с анализом ДНК с помощью комплементарного меченого зонда.
| Метод | Исследуемая молекула | Основной принцип выявления | Типичный результат | Применение |
|---|---|---|---|---|
| Southern blot | ДНК | Гибридизация меченого зонда с комплементарным фрагментом ДНК после рестрикции и электрофореза | Полоса определённого размера | Крупные делеции, дупликации, перестройки, RFLP, анализ повторов |
| Northern blot | РНК | Гибридизация зонда с разделёнными молекулами РНК | Полоса, соответствующая размеру транскрипта | Исследование экспрессии и размера транскриптов |
| Western blot | Белки | Иммунологическое связывание белка со специфическими антителами | Иммунореактивная полоса | Подтверждение наличия белка или антител к нему |
| Рестрикционный анализ | ДНК | Расщепление эндонуклеазами с последующим электрофорезом | Набор фрагментов различной длины | Оценка структуры ДНК, но без обязательного специфического выявления гена |
| PCR | Выбранный участок ДНК или кДНК | Амплификация последовательности праймерами | Ампликон заданного размера или количественный сигнал | Быстрое выявление точечных вариантов и небольших фрагментов |
| FISH | ДНК в интерфазных ядрах или хромосомах | Гибридизация флуоресцентного зонда непосредственно с клеточным материалом | Флуоресцентные сигналы в определённых локусах | Анеуплоидии, микроделеции, амплификации и транслокации |
Ключевой диагностический признак метода Саузерна — специфическая полоса на мембране, положение которой отражает размер рестрикционного фрагмента, содержащего искомую последовательность. Изменение длины или числа полос может указывать на вариант рестрикционного сайта, делецию, вставку или перестройку. В современной лабораторной генетике метод во многих задачах заменён ПЦР, MLPA и секвенированием нового поколения, но сохраняет значение при анализе крупных структурных вариантов и повторяющихся последовательностей. Результаты интерпретируют с учётом используемой рестриктазы, размера зонда и контрольного образца.