2) 37-42
3) 95-98 (+)
4) 50-60
Температурный диапазон 95–98 °C используется для денатурации двухцепочечной ДНК, поскольку при таком нагревании разрушаются преимущественно нековалентные взаимодействия, стабилизирующие двойную спираль, прежде всего водородные связи между комплементарными азотистыми основаниями. При этом ковалентный фосфодиэфирный остов цепей ДНК сохраняется, а две комплементарные цепи расходятся и становятся доступными для последующего связывания праймеров.
Этот принцип лежит в основе полимеразной цепной реакции. Каждый цикл ПЦР начинается с высокотемпературной денатурации матричной ДНК, после чего температуру снижают для отжига праймеров, а затем устанавливают оптимальные условия для работы термостабильной ДНК-полимеразы. Точная температура плавления конкретного фрагмента зависит от его длины, содержания GC-пар, концентрации солей и других параметров реакционной смеси, однако для надежного разделения цепей в стандартной ПЦР обычно применяют нагрев примерно до 95 °C и выше.
| Этап или процесс | Типичная температура | Основное молекулярное событие |
|---|---|---|
| Денатурация ДНК | 95–98 °C | Разделение двух комплементарных цепей ДНК |
| Отжиг праймеров | Примерно 50–65 °C | Гибридизация праймеров с комплементарными участками матрицы |
| Элонгация при использовании Taq-полимеразы | Около 72 °C | Синтез новой цепи ДНК в направлении 5′→3′ |
| Физиологическая температура | Около 37 °C | Двухцепочечная ДНК в обычных условиях сохраняет стабильность |
| Температура плавления Tm | Зависит от последовательности | Приблизительно половина молекул ДНК находится в денатурированном состоянии |
| Повышенное содержание GC | Повышает Tm | GC-богатые участки обычно требуют более высокой температуры для расплетания |
Денатурацию следует отличать от деградации ДНК: при стандартном нагревании в ПЦР цепи разделяются без преднамеренного разрушения их фосфодиэфирных связей. После снижения температуры комплементарные цепи способны вновь образовывать двойную спираль, что называется ренатурацией или реассоциацией. Поэтому высокотемпературный этап является обратимым физико-химическим процессом и необходимым условием циклической амплификации нуклеиновой кислоты.